JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Arabidopsis'te m5C Modifikasyonu Çalışmak için Metillenmiş RNA İmmün Prempripitasyon Tahlil

Published: May 14, 2020
doi:
10.3791/61231
, , ,
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, 2Department of Molecular Medicine, Medical School,University of Padua, 3Biologie de l’Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France

Summary

Metillenmiş RNA immün önksepitasyon testi, metillenmiş RNA parçaları için zenginleştirmek için kullanılan antikor bazlı bir yöntemdir. Derin sıralama ile birleştiğinde, m5C modifikasyonlarını taşıyan transkriptlerin tanımlanmasına yol açar.

Abstract

M5C gibi RNA’daki ikincil baz modifikasyonları, modifiye edilmiş RNA moleküllerinin yapısını ve işlevini etkiler. Metillenmiş RNA İmmün önsepeksiyon ve dizileme (MeRIP-seq), metillenmiş RNA için zenginleştirmeyi ve sonuçta değiştirilmiş transkriptleri tanımlamayı amaçlayan bir yöntemdir. Kısaca, sonicated RNA 5 metillenmiş sitozinler için bir antikor ile inkübe edilir ve protein G boncuklarının yardımıyla çökeltilir. Zenginleştirilmiş parçalar daha sonra sıralanır ve okumaların dağılımına ve tepe algılamasına göre potansiyel metilasyon siteleri eşlenir. MeRIP, herhangi bir organizmaya uygulanabilir, çünkü önceden herhangi bir dizi veya enzim bilgisini değiştirme gerektirmez. Ek olarak, parçalanmanın yanı sıra, RNA başka bir kimyasal veya sıcaklık tedavisine tabi değildir. Bununla birlikte, MeRIP-seq, metilasyon bölgesinin diğer yöntemlerde olduğu gibi tek nükleotid tahminini sağlamaz, ancak metillenmiş alan birkaç nükleotide kadar daraltılabilir. Farklı modifikasyona özgü antikorların kullanılması, MeRIP’in RNA’da bulunan farklı baz modifikasyonları için ayarlanmasını sağlar ve bu yöntemin olası uygulamalarını genişletir.

Introduction

Yaşamın her üç krallığında da, RNA türleri transkripsiyon sonrası değişikliklere uğrar ve işlevsel olarak ilgili bu biyokimyasal değişiklikler üzerindeki araştırmalara “epitranscriptomics” denir. Epitranscriptomics büyüyen bir alandır ve RNA molekülleri üzerindeki değişiklikleri incelemek ve haritalamak için çeşitli yöntemler geliştirilmektedir(1,2’degözden geçirilmiştir). RRNA’larda, tRNA’larda, diğer ncRNA’larda ve mRNA’larda3,4’tetespit edilen yüzden fazla RNA değişikliği bulunmuştur. TRNA’larda ve rRNA’larda kimyasal olarak çeşitli transkripsiyon sonrası modifikasyonların varlığı ve işlevi kapsamlı bir şekilde çalışılsa da5,6,7,8, sadece son zamanlarda mRNA modifikasyonları karakterize edilmiştir. Bitkilerde, 9 , m 1 A 10 , hm 5 C 11,12ve uridylation13kapakyapısında m7G dahil olmak üzere bugüne kadar birçok mRNA modifikasyonu tanımlanmıştır. Bununla birlikte, Arabidopsis’te sadecem6A10,14 ,15,m5C 11,16,17 ve psödouridine18 transcriptome-wide haritalanmıştır. Transkripsiyon sonrası mRNA baz modifikasyonları çeşitli gelişimsel süreçlerde yer almaktadır19,20.

Epitranscriptomics’te en sık kullanılan yaklaşımlardan biri, metillenmiş RNA immünorektasyonu ve derin dizilemedir (MeRIP-seq). MeRIP-seq 2012 yılında memeli hücrelerinde m6A çalışması için geliştirilmiştir21,22. İstenilen modifikasyon için bir antikor kullanılmasını gerektirir ve modifiye nükleotidleri taşıyan RNA parçaları için zenginleştirmeyi amaçlamaktadır. Genellikle zenginleştirilmiş parçaları veya belirli RNA hedeflerini doğrulamak için nicel PCR’yi tanımlamak ve eşlemek için derin sıralama takip edilir. MeRIP’in doğruluğu, benzer değişiklikler (örneğin, m 5 C vehm5 C11,23)üzerinde modifiye nükleotidleri tanımak için antikorun özgüllüğüne dayanır. m6A’nın yanı sıra, MeRIP-seq ayrıca çeşitli organizmalardam 1 Ave m5C RNA metilasyon çalışması için uygulanmıştır11,17,23,24,25.

Sitozinin beşinci karbon pozisyonunda (m5C) metilasyonu en yaygın DNA modifikasyonu26,27 ve en yaygın RNA modifikasyonlarından biridir3,4. 1975 28yılındaökaryotik mRNA’larda m5C tespit edilirken, sadece son zamanlarda modifikasyon transkriptome çapında, kodlama ve kodlama dışı RNA’larda 11,16 ,17, 23,29,30,31,32,33,34haritalamaya odaklanan çalışmalar vardır.

m5C RNA araştırmalarında kullanılan alternatif yöntemler arasında metil olmayan sitozinlerin kimyasal olarak urasillere dönüştürülmesi (bisülfit dizilimi) ve bilinen bir RNA sitozin metiltransfezinin RNA hedeflerine (miCLIP, aza-IP) geri dönüşü olmayan bir bağlanmasına dayanan immün özürlülük tahlilleri sayılabilir. Kısacası, bisülfit dizilimi, 5 metillenmiş sitozinin, değiştirilmemiş sitozinleri urasil’e deaminasyon eden sodyum bisülfit tedavisine dirençli olma özelliğinden yararlanır. Yöntem ilk olarak DNA için geliştirilmiştir, ancak RNA için de uyarlanmıştır ve birçok çalışma RNA16, 23 , 29 , 32,34,35’tem5C bölgelerini tespit etmek için bu yaklaşımı seçmiştir. Hem miCLIP hem de aza-IP, RNA sitozin metiltransfeaz hakkında daha önce bilgi sahibi olmak ve ilgili antikorun kullanımını gerektirir. MiCLIP (metilasyon birey-nükleotid çözünürlüklü çapraz bağlama ve immün önkupitasyon) durumunda, metiltransfeaz tek bir amino asit mutasyonu taşır, böylece RNA substrata bağlanır, ancak serbest bırakılamaz30. Aza-IP’de (5-azacytidine aracılı RNA immün önkupitasyon), 5-azaC nükleozid ve RNA sitozin metiltransferaz arasında geri dönüşü olmayan bağlama oluşur eksojen olarak sağlandığında 5-azaC RNA polimerazları tarafından hedef RNA molekülü31’edahil edilir.

Bu üç yöntemin temel avantajı, m5C’nin tek nükleotid çözünürlük haritalamasına izin vermeleridir. Ek olarak, miCLIP ve aza-IP, transkripsiyonel RNA modifikasyonlarının mekanizmasını ve rolünü daha derinden deşifre ederek, seçilen bir RNA sitozin metiltransfenazının belirli hedefleri hakkında bilgi sağlar. Bununla birlikte, MeRIP-seq yaklaşımı, daha önce gerekli herhangi bir bilgi olmadan transkriptom çapındaki m5C bölgelerini tanımlayabilir ve bisülfit tedavisi veya 5-azaC ile inkübasyon gibi zorlu kimyasal ve sıcaklık koşullarından kaçınır. Hem MeRIP hem de bisülfit dizilimi ikincil RNA yapıları tarafından inhibe edilebilir36. İmmün prempripitasyondan önce MeRIP testinde yer alan parçalanma adımı antikor bağlanmasını kolaylaştırmayı ve m5C tanımlama çözünürlüğünü artırmayı amaçlamaktadır.

Bahsetmeye değer bir diğer yöntem de RNA nükleozidlerinin kütle spektrometresi (MS). MS, hem DNA’da hem de RNA’da her türlü modifikasyonu tespit edebilir ve ayırt edebilir. Kısaca, RNA çıkarılır ve DNaz sindirilir, daha sonra tuzdan arındırılır ve tek nükleozidlere sindirilir. RNA nükleozidleri kütle spektrometresi ile analiz edilir. Bu yöntem, her modifikasyonun seviyelerini ölçmek için kullanılabilir ve bir antikora veya kimyasal dönüşüme dayanmaz. Ancak, önemli bir dezavantajı, RNA değişikliklerinin varlığı hakkında toplu bilgi sağlamasıdır. Modifikasyonları haritalamak için MS’in, insan tRNALeu(CAA)37örneğinde olduğu gibi, belirli RNA molekülleri hakkında RNaz sindirimi ve dizileme bilgileri ile birleştirilmesi gerekir.

Burada, Arabidopsis17’dem5C RNA metilasyonını incelemek için kullanılan MeRIP testini tanımlıyor ve tartışıyoruz.

Protocol

1. RNA’nın Hazırlanması 200 mg bitki dokusunu sıvı nitrojende toz haline getirin, dokunun işlem boyunca donmuş kalmasını sağlamak. Bir asit guanidinium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyon protokolünden sonra RNA’yı istenen bitki dokusundan çıkarın. Faz ayrımı sırasında RNA’yı DNA ile kirletme olasılığını azaltmak için kloroform yerine 1-bromo-3-kloropropane kullanın. Öğütülen bitki dokusuna guanidin tiyosiyanat ve asit fenol içeren 1 mL RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyin (100 mg doku başına 500 μL). Ters çevirerek iyice karıştırın ve tüm dokunun ıslak olduğundan emin olun. Ribonucleoprotein komplekslerini ayrıştırmak için oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. 4 °C’de 12.000 x g’da 10 dakika santrifüj ve süpernatantı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın. 200 μL 1-bromo-3-kloropropane (500 μL RNA ekstraksiyon reaktifi başına 100 μL) ve girdabı kuvvetlice ekleyin. 4 °C’de 12.000 x g’da 15 dakika santrifüj ve üst sulu fazı (yaklaşık 500 μL) yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın. 1 hacimli izopropanol (500 μL) ve 0,1 hacim 3 M sodyum asetat pH 5,5 (50 μL) ekleyin, -20 °C’de 10 dakika ters çevirip çökelterek iyice karıştırın.NOT: RNA yağışını arttırmak için sodyum asetat (NaOAc) kullanılması önerilir. Protokol bu noktada RNA’nın yağışını birkaç saat hatta bir gecede uzatarak duraklatılabilir. 4 °C’de 12.000 x g’da 30 dakika santrifüj ve süpernatantı atın. Peletı 500 μL% 80 EtOH ile iki kez yıkayın, 4 ° C’de 12.000 x g’da 5 dakika santrifüj ve atın. Peletı bir kez 500 μL% 99 EtOH ile yıkayın, 4 ° C’de 12.000 x g’da 5 dakika santrifüj ve atın. Peleti 5-10 dakika kurutun ve 30 μL RNase içermeyen H2O’da çözün.NOT: Bunun yerine, seçtiğiniz herhangi bir RNA ayıklama protokolünü (örneğin, sütun tabanlı bir sistem) kullanın. Bir DNase sindirimi protokole dahil edilirse, aşağıdaki adımda atlayın (adım 1.3). RNA konsantrasyonunu ölçün (örneğin, spektrofotometre kullanarak) ve 20 μg RNA’yı DNase ile sindirin.NOT: DNA m5C bakımından zengindir ve antikor DNA ve RNA arasında ayrım yapmaz. Tipik bir DNase reaksiyonunda, 50 μL reaksiyonda 10 μg RNA’yı tedavi edin. Aşağıdaki bileşenleri karıştırın ve reaksiyonları 37 °C’de 30 dakika kuluçkaya yatırın:10 μg RNA x μL10x DNase tampon 5 μLDinaz 1 μL (2 birim)RNase içermeyen H2O 50 μL’ye kadar Enzimi, uygun miktarda DNase inaktivasyon reaktifi ekleyerek (DNaz kitine dahilse ve üreticinin talimatlarına göre) veya bir temizleme adımı (örneğin, kolon saflaştırma veya fenol/ kloroform ekstraksiyonu) gerçekleştirerek çıkarın. Kılcal elektroforez ile izole RNA’nın kalitesini ve saflığını kontrol edin ve numunelerin kaliteli olduğundan emin olmak için RNA bütünlük numarası (RIN) 7’den yüksekse devam edin. İsteğE BAĞLI: Bir rRNA kaldırma kiti kullanarak ve üreticinin protokolüne göre mRNA içeriğindeki örnekleri zenginleştirmek için ribozomal RNA’yı çıkarın. RRNA tükenme reaksiyonları için önceki adımdan DNase ile tedavi edilen RNA’yı kullanın. Toplam RNA miktarı reaksiyon için önerilen maksimum miktardan fazlaysa birden fazla reaksiyon gerçekleştirin. RRNA tükendikten sonra giriş miktarının sadece %5-10’unun kurtarılacağını unutmayın. rRNA tükenmiş RNA’ya (tüm örnekler için eşit tutar) devam edin ve toplam RNA’ya atıfta bulunduğundan, aşağıdaki adımlarda belirtilen tutarları yoksayın.NOT: Kullanılabilir rRNA tükenme yöntemlerinin karşılaştırılması ve açıklaması için bkz. rRNA, toplam RNA’nın önemli bir parçasıdır ve birçok organizmada m5C metillenmiştir. Kontrol RNA dizileri olarak kullanılmak üzere önceden in vitro transkriptleri (IVT) hazırlayın ve örneklere ekleyin. MeRIP’te sırasıyla negatif ve pozitif kontroller olarak hizmet etmek için biri metilasyonsuz nükleozidli ve diğeri rCTP’nin 5-metil-rCTP ile değiştirildiği bir in vitro transkripsiyon kiti kullanarak iki farklı IVT üretin. Hazırlanan transkriptler EGFP ve Renilla luciferase’nin transkriptleriydi.NOT: IVT’ler analiz ettiğiniz organizmanın transkriptomunda bulunmamalıdır. IVT’ler aynı şablondansa (örneğin, her ikisi de EGFP), pozitif ve negatif kontrolü iki farklı örneğe ekleyin. Dizileri farklıysa (örneğin EGFP ve Renilla), aynı örneğe eklenebilirler. Kontroller olarak her numunede 3 μg RNA başına 0,1 ng IVT artış. RNA’yı yaklaşık 100 nt parçaya ayırın.NOT: RNA kesme koşulları önceden ayarlanmalıdır ve her sonicator için farklılık gösterir. Burada kullanılan model için sonication aşağıdaki koşullarla gerçekleştirilir: Tepe gücü 174, Görev faktörü 10, Döngüler / patlama 200, 17 dk. RNase içermeyen H 2 O ile doldurulmuş, toplam hacmin 80 μL’sinde (min 60 μL, maksimum 100 μL) numune başına en az12μg RNA olan tüm numuneler için aynı miktarda RNA’yı sonicate edin. Sonikasyonun verimliliğini ve RNA örneklerinin kılcal elektroforez ile konsantrasyonunu onaylayın. Parçalanmış RNA’nın ortalama boyutu 100 nt civarında olmalıdır. 2. Metillenmiş RNA İmmün Önseçme (MeRIP) Düşük bağlayıcı tüplerde, konsantrasyona bağlı olarak 60 μL’ye (veya daha fazla) kadar 9 μg sonicated RNA ve RNase içermeyen H2O ekleyin. RNA’yı bir su banyosunda 70 °C’de 10 dakika ısıtarak ve bir buzlu su karışımında 10 dakika daha soğutarak ikincil yapıları ayrıştırın. Numuneyi üç parçaya bölün: Giriş örneği olarak -80 °C’de ayrı bir tüpe üçte biri (2.1 adımında 60 μL alınmışsa 20 μL) kaydedilir. Kalan 40 μL’yi 860 μL’ye kadar RNase içermeyen H2O ile doldurun ve ardından iki düşük bağlayıcı tüpe bölün: biri IP ve diğeri Mock kontrolü için (her biri 430 μL). Her iki tüpe de ekleyin:50 μL 10x MeRIP tampon10 μL RNaz inhibitörüMock örneğinde 10 μL H 2 O başına IP örneğinde 10 μL α-m5C antikor(10μg)NOT: Daha önce kullanılan antikor klonu artık ticari olarak mevcut değildir. Bununla birlikte, herhangi bir anti-5-metilistikozin monoklonal antikor benzer şekilde çalışmalıdır. Antikorlar MeRIP11,23için kullanılmadan önce özgüllük için test edilmelidir. Tüpleri parafilm ile kapatın ve tepegöz dönüşü ile 4 °C’de 12-14 saat kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, protein G manyetik boncuklarını bağlama için hazırlayın. Her tüp için (IP veya Mock kontrolü), 40 μL boncuk kullanın. Toplam boncuk miktarını ekleyin (# tüp sayısı x 40 μL, örneğin, 2 IP ve 2 Mock numunesi için, 160 μL boncuk gereklidir) 15 mL’lik bir tüpte ve numune başına 800 μL 1x MeRIP tamponu ile üç kez yıkayın (# tüp x 800 μL tampon, örneğin, 2 IP ve 2 Mock numuneleri için 3,2 mL). Havai dönüş ile 5 dakika boyunca oda sıcaklığında yıkamalar gerçekleştirin, boncukları manyetik bir raf yardımıyla toplayın ve yıkama tamponu atın. Üçüncü yıkamadan sonra, boncukları alınan boncukların ilk hacmiyle aynı hacimde 1x MeRIP tamponunda yeniden ıslatır (# tüp x 40 μL, örneğin, 2 IP ve 2 Mock numunesi için 160 μL 1x MeRIP tampon).NOT: Kullanılan protein G boncuk miktarı, boncukların spesifik antikor tipi için bağlanma kapasitesine ve kullanılan antikor miktarına göre belirlenir. Bu durumda, boncuklar, boncuk mg’ı başına yaklaşık 8 μg fare IgG ve 30 mg / mL konsantrasyonu bağlama kapasitesine sahiptir. Bu nedenle, yaklaşık 9,6 μg antikor bağlamak için 40 μL yeterlidir. Her IP ve Mock örneğine 40 μL resüspended boncuk ekleyin ve tepegöz dönüşü ile 4 °C’de 2 saat daha kuluçkaya yatırın. Tüpleri 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatant atın veya kontrol olarak kaydedin (bağlı olmayan RNA örneği). %0,01 Ara 20 ile birlikte verilen 700 μL’lik 1x MeRIP tamponunda yeniden canlanarak ve havai dönüş ile oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırarak boncukları 5 kez yıkayın. Yıkanmış boncukları 200 μL Proteinaz K sindirim tamponunda yeniden ıslatın ve 50 °C’de 3 saat boyunca 800 rpm’de sallanarak 3,5 μL Proteinase K. Incubate ekleyin. Bazen, kuluçka sırasında bir boncuk tortusu oluşuyorsa, tüpün altına manuel olarak vurun. RNA’yı 800 μL RNA ekstraksiyon reaktifi ek olarak ve bir asit guanidinium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyon protokolünü izleyerek çıkarın ve adım 1.2’deki gibi devam edin. RNA peletinin görünürlüğünü artırmak için, yağış adımında izopropanol içine renkli bir yardımcı çökelti eklenebilir. Peleti 20 μL RNase içermeyen H2O’da (veya adım 2.3’te tutulan Giriş hacmine eşit) yeniden sakla. 3. Aşağı akış analizi 50 temel okuma uzunluğuna (SE50) sahip tek uçlu sıralama için Giriş ve IP örneklerini gönderin. Cutadapt41 kullanarak 3′ uç adaptörleri kırpın ve 48 nt’den kısa okumaları atın. Harita kesilmiş, uyumsuzlar için% 6’lık bir kesme ve maksimum 10 kb intron boyutu ile STAR42 kullanarak Arabidopsis genomuna (TAIR10 ek açıklama) okur. Daha fazla analiz için benzersiz haritalı okumalar tutun. İki farklı yöntem kullanarak Giriş’e kıyasla IP örneklerinde zenginleştirilmiş RNA parçalarını tanımlayın ve her ikisi tarafından önemli ölçüde zenginleştirilmiş olanları göz önünde bulundurun. İlk olarak, havuza alındı IP’lerde MacS2 tepe arayan43’ü kullanarak MeRIP-seq tepelerini algılayın. İkinci olarak, Meyer ve ark.22 ve Yang ve ark.17’deaçıklandığı gibi MeRIP-seq tepe çağrısı analizini izleyin. Özel R komut dosyaları kullanarak, genomunu farklı 25 nt pencerelere bölün ve son eşlenen nükleotitin konumuna göre her pencere için benzersiz olarak eşlenen okuma sayısını sayın (okumalar 100 nt RNA parçalarından kaynaklandığından). IP örneklerinde, Fisher Exact Testi ile Giriş ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde zenginleştirilmiş pencereleri hesaplayın. En az iki ardışık pencereye yayılan önemli ölçüde zenginleştirilmiş tepeleri koruyun ve yalnızca bir pencereyi kaplayan tepeleri atın. Genomun açıklamalı bölgelerini (transkriptler) her iki yöntem tarafından bulunan önemli ölçüde zenginleştirilmiş zirvelerle tanımlayın. Alternatif veya tamamlayıcı olarak, belirli RNA hedeflerini IP örneklerinde zenginleştirmeleri için test edin. RNA’yı (aynı giriş hacmi, IP ve Mock örnekleri) rastgele altıgenlerle ters yazıya dök. ΔΔCt yöntemiyle Giriş, IP ve Mock’u karşılaştırarak seçilen hedeflerde nicel gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin.NOT: Ortalama parçalanma boyutu olduğundan, oluşturulan ürün 100 bp’den uzun olmamalıdır.

Representative Results

Yöntemin şeması Şekil 1 ‘de verilmiştir. Protokolün ilk kritik adımları, kaliteli RNA (RIN ≥ 7) elde etmek ve yaklaşık 100 nt parçaya sonalatmaktır. Her iki adımın verimliliği çip bazlı kılcal elektroforez makinesi tarafından incelenir. Şekil 2A’da,iyi bir RNA örneğinin temsili bir çalışması gösterilmiştir. Numune, kullanılan kiti algılama aralığında (5-500 ng/μL) bir konsantrasyona sahip olmak için çipe yüklenmeden önce 1:10’da seyreltilir. Aynı örnek sonikasyondan sonra da çalıştırılır ve Şekil 2B’de gösterilir. Yaklaşık 100 nükleotid büyüklüğünde diyagramın soluna kaydırılmış tek tip bir tepenin varlığına dikkat edin. Düşük konsantrasyon, hem parçalanma sırasında RNA kaybından hem de numunelerin hacminin artmasından kaynaklanır (60-100 μL, adım 1.7.1). IP ve Mock örneklerinin kalitesi qRT-PCR ile değerlendirilebilir. Bu amaçla, çivili IVT’ler pozitif ve negatif kontroller olarak hizmet eder: tüm sitozin pozisyonlarında m5C bulunan metillenmiş IVT’nin IP örneğinde yüksek oranda zenginleştirilmesi beklenir; aksine, metillenmemiş IVT’nin IP ve Mock arasında bir fark olmamalıdır. İki kontrol IVT’si(EGFP ve Renilla luciferaz) için qRT-PCR testinde kullanılan astarlar Tablo 1’de listelenmiştir. Gerçekten de, Şekil 3’tegösterildiği gibi, metillenmiş IVT’nin yaklaşık% 80’i IP örneğinde ve sadece% 2’si Mock’ta ele geçirildi. Metillenmemiş kontrol için, kurtarma hem IP hem de Mock örneklerinde% 1’in altındaydı. Bu, metillenmiş RNA parçalarının çöke atıldığını ve zenginleştiğini MeRIP’in verimliliğini doğrular ve numunelerin aşağı akış analizi için kullanılabileceğinin iyi bir göstergesidir. Buna ek olarak, metillenmemiş IVT’nin kat zenginleştirmesi (IP’den Mock’a oran) qRT-PCR testlerinde zenginleştirmenin önemini tahmin etmek için bir eşik olarak uygulanabilir. Okumaları genoma hizaladıktan sonra (Şekil 4), 3.4.1 ve 3.4.2 adımlarında açıklanan tepe çağırma algoritmaları, GIRIŞe kıyasla IP örneklerinde zenginleştirilmiş istatistiksel olarak anlamlı pencereleri tanımlamak için uygulanır. Bu pencerelere karşılık gelen diziler, örneğin metilasyonla ilgili motifleri aramak için daha fazla kullanılabilir11,17. Şekil 1: MeRIP-seq protokolünün şematik gösterimi.RNA örnekleri 5 metillenmiş sitozinler için bir antikor ile inkübe edilir ve kompleksler bağlı RNA ile birlikte antikorları yakalayan protein G manyetik boncuklarla aşağı çekilir. Eluted RNA örnekleri derin sıralama ve qRT-PCR ile analiz edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: RNA örneklerinin kalite analizinden elde edilen temsili sonuçlar.(A) Nitelikli toplam RNA bitki örneğinin temsili profili. (B) Sonication sonra bir RNA örneğinin temsili profili 100 nt parçalara. Kılcal elektroforez yazılımından çıktı dosyaları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: kontrol IVT’lerinin qRT-PCR analizi.Metillenmiş ve metil olmayan in vitro transkriptler sırasıyla MERIP testinin pozitif ve negatif kontrolleri olarak kullanılmıştır. İmmün prekipitasyondan sonra, metillenmiş IVT IP örneğinde (yeşil) yüksek oranda zenginleştirilir, ancak Mock örneğinde (anti-m5C antikor olmadan; mor). Metillenmemiş IVT, IP ve Mock arasında zenginleştirme ve fark göstermedi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: MeRIP öncesi ve sonrası hizalamayı temsili bir transkript etrafında okuyun.Giriş örneğinde (üst satır) ve iki IP çoğaltmasında (orta ve alt satır) belirli bir döküme hizalanmış okur. Kara kutu, MACS243 ve MeRIP-seq22 tepe arama analizlerine dayanan tanımlanmış zenginleştirilmiş 50 nt uzunluğunda bir pencere gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Hedef Astar çifti Ürün sırası Ürün uzunluğu EGFP İçin: 5′- GGCAACTACAAGACCCGCGCC -3′ GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC 72 bp Devir: 5′- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3′ Renilla lucifeze İçin: 5′- GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAAC -3′ GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACCATGTTGCCATCAAAAAATCATGAGAAAGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC 75 bp Rev: 5′- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAA -3’ Tablo 1: qRT-PCR analizi için astarlar ve oluşturulan ürünler hakkında bilgi. Tampon Tarifleri. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

RNA, epitranscriptome44’ü oluşturan yüzden fazla farklı temel değişiklik4taşır. Bu değişiklikler, çeviri ve sinyalizasyonun ek bir düzenleme katmanını ekler(5,6,8,20,45,46‘da incelenmiştir). İlk çalışmalar RNA28,47’de transkripsiyon sonrası değişikliklerin varlığını tespitedebildi,ancak epitranscriptomiklerin rolünü anlamak için belirli modifiye RNA’ların tanımlanması gerekiyor. MeRIP, RNA metilasyon sitelerini haritalamak için bir yöntem olarak tasarlanmıştır transcriptome-wide21,22. Belirli bir antikor varsa, herhangi bir değişikliğe uyarlanabilir.

Bu protokolün ana gücü, RNA ve kullanıcı için nispeten basit, güvenli olmasıdır (örneğin, 5-azaC bitkiler ve insanlar için oldukça zehirlidir) ve dizi veya enzim bilgilerini değiştirme gerektirmez. Ayrıca, metillenmiş RNA’ların IP tarafından zenginleştirilmesi, zenginleştirme adımı içermeyen bisülfit diziliminin aksine, düşük bol miktarda mRNA’nın algılanma şansını artırır. İki seri MeRIP turu gerçekleştirildiğinde, metilasyon alanlarını içeren RNA parçalarında zenginleştirme daha da artar22. Özellikle mRNA metilasyon çalışmalarına uygulandığında MeRIP’in sınırlamalarından biri, test için giriş olarak gereken yüksek miktarda RNA’dır. Ribodepletion – veya poly(A) zenginleştirme – adımı ağır modifiye ribozomal RNA’nın neden olduğu arka planı azaltacaktır, ancak toplam RNA’nın% 90’ından fazlasını giderir. DNA, 5 metillenmiş sitozin bakımından zengin olduğu için tamamen çıkarılmalıdır. Diğer bir dezavantaj, metilasyonun tam konumunun daha düşük çözünürlüğüdür. Antikor ile inkübasyondan önce RNA’nın sonication 100-200 nükleotidler için modifikasyon içeren bölgeyi daraltarak bu yönde yardımcı olur. MeRIP derin sıralama ile birleştirildiğinde, sıralama okumaları potansiyel metilasyon alanı etrafında gauss dağılımı oluşturdukça m5C site tahmininin çözünürlüğü artar. Ek olarak, antikorun özgüllüğünün testlerden önce doğrulanması gerekir (örneğin, modifiye nükleotitlerle sentezlenen oligos ile gerçekleştirilen RNA nokta lekeli testlerle), ancak bir antikorun aslında yakından ilişkili modifikasyonları (örneğin, m6A ve m6Am) ne ölçüde ayırt edebileceği48,49alanında bir tartışma noktasıdır. Ayrıca, yüksek yapılandırılmış RNA’lar antikor-antijen etkileşimini engelleyebilir, bu da çoğunlukla IP’den önce RNA’nın parçalanması ve denatürasyonu ile giderilen başka bir kısıtlamadır. Aksine, ikincil yapılardan da etkilenen bisulfite dizilimi bir parçalanma adımı içermez ve bu, bisulfite dizilimi16ve MeRIP-seq11 ,17tarafından tahmin edilen m5 C siteleri ile mRNA’lar arasında tutarsızlığa neden olan bir neden olabilir. Diğer sitozin modifikasyonları (örneğin, hm5C) bisülfit aracılı deaminasyona karşı da dirençlidir35.

MeRIP-seq’in modifikasyonları bir çapraz bağlama adımı içerir, ya fotoaktiviva edilebilir ribonucleoside (foto-çapraz bağlama destekli m6A-seq, PA-m6A-seq 50)veya IP’den sonra antikor-RNA çapraz bağlantıları oluşturmak için UV ışığı kullanarak (miCLIP49, giriş30’daaçıklanan miCLIP’ten farklı yöntem , aynı zamanda bireysel nükleotid çözünürlüğü ile). Gelecekte ve RNA metilasyonu hakkındaki bilgi biriktiğinden, modifiye enzimlere ve/ veya metilasyonun göründüğü konsensüs dizilerine dayanarak daha hedefli yaklaşımlar tercih edilebilir. Okuyucu proteinlerin tanımlanması, transkripsiyon sonrası değişikliklerin moleküler ve sinyal işlevinin anlaşılması için gereklidir. Nanopore dizileme teknolojisi, RNA17’nin önceden tedavisi olmadan modifiye nükleotidlerin doğrudan tanımlanmasına izin verir, ancak bu alanda dizi derinliği ve biyoinformatik analiz konusunda hala iyileştirme için yer vardır. Genel olarak, MeRIP-seq şu anda metillenmiş RNA transkriptlerini tanımlamak için yerleşik, güvenilir ve tarafsız bir yaklaşımdır.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, E.S.’ye imprs doktora ödeneği, V.P.’ye EMBO Uzun Vadeli Burs ve F.K.’ye MPI-MPP iç fonları ile desteklenmiştir. Yazarlar, makale hakkındaki biyoinformatik analiz ve yorumlar için Federico Apelt’e ve biyoinformatik analiz için Mathieu Bahin ve Amira Kramdi’ye teşekkür eder.

Materials

α‐m5C antibody ZymoResearch A3001 (discontinued), A3002 available Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available
Chip and reagents for capillary electrophoresis Agilent 5067-1511 RNA 6000 Nano kit
Dnase Ambion AM1907 TURBO DNA-free kit
Co-precipitant of nucleic acids Ambion AM9515 Glycoblue, 15 mg/mL
In vitro transcription kit Promega P1300 T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System
Low-binding reaction tubes Kisker Biotech G017 1.7 ml microcentrifuge tubes
Protein G magnetic beads Invitrogen 10003D Dynabeads Protein G
Proteinase K Ambion AM2546 20mg/mL stock solution, RNA grade
RNase inhibitor Promega N2615 RNasin Plus 40 U/μl
rRNA removal kit Epicentre RZPL11016 Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)
Sonication tubes Covaris 520045 microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm
RNA extraction reagent Ambion 15596018 TRIzol reagent
Equipment
Capillary electrophoresis machine Agilent G2939BA 2100 Bioanalyzer System
Magnetic rack Invitrogen 12321D DynaMag-2
Microentrifuge Eppendorf discontinued 5417R model
Rotator Benchmark R4040 RotoBot Mini
Sonicator Covaris 500217 S220 Focused-ultrasonicator
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONEC-W NanoDrop OneC
Waterbath GFL 1012 1012 Incubation bath
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trixl, L., Lusser, A. The dynamic RNA modification 5-methylcytosine and its emerging role as an epitranscriptomic mark. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), 1-17 (2019).
  2. Mongan, N. P., Emes, R. D., Archer, N. Detection and analysis of RNA methylation. F1000Research. 8, 559 (2019).
  3. Cantara, W. A., et al. The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update. Nucleic Acids Research. 39, 195-201 (2011).
  4. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (1), 303-307 (2018).
  5. Agris, P. F. Bringing order to translation: the contributions of transfer RNA anticodon-domain modifications. EMBO reports. 9 (7), 629-635 (2008).
  6. Chow, C. S., Lamichhane, T. N., Mahto, S. K. Expanding the Nucleotide Repertoire of the Ribosome with Post-Transcriptional Modifications. ACS Chemical Biology. 2 (9), 610-619 (2007).
  7. Gigova, A., Duggimpudi, S., Pollex, T., Schaefer, M., Koš, M. A cluster of methylations in the domain IV of 25S rRNA is required for ribosome stability. RNA. 20 (10), 1632-1644 (2014).
  8. Motorin, Y., Helm, M. tRNA Stabilization by Modified Nucleotides. Biochemistry. 49 (24), 4934-4944 (2010).
  9. Shatkin, A. Capping of eucaryotic mRNAs. Cell. 9 (4), 645-653 (1976).
  10. Shen, L., et al. N 6 -Methyladenosine RNA Modification Regulates Shoot Stem Cell Fate in Arabidopsis. Developmental Cell. 38 (2), 186-200 (2016).
  11. Cui, X., et al. 5-Methylcytosine RNA Methylation in Arabidopsis Thaliana. Molecular Plant. 10 (11), 1387-1399 (2017).
  12. Huber, S. M., et al. Formation and abundance of 5-hydroxymethylcytosine in RNA. ChemBioChem. 16 (5), 752-755 (2015).
  13. Zuber, H., et al. Uridylation and PABP Cooperate to Repair mRNA Deadenylated Ends in Arabidopsis. Cell Reports. 14 (11), 2707-2717 (2016).
  14. Luo, G. Z., et al. Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana. Nature Communications. 5 (1), 5630 (2014).
  15. Wan, Y., et al. Transcriptome-wide high-throughput deep m6A-seq reveals unique differential m6A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana. Genome Biology. 16 (1), 1-26 (2015).
  16. David, R., et al. Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs. The Plant Cell. 29 (3), 445-460 (2017).
  17. Yang, L., et al. m5C Methylation Guides Systemic Transport of Messenger RNA over Graft Junctions in Plants. Current Biology. 29 (15), 2465-2476 (2019).
  18. Sun, L., et al. Transcriptome-wide analysis of pseudouridylation of mRNA and non-coding RNAs in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 70 (19), 5089 (2019).
  19. Chmielowska-Bąk, J., Arasimowicz-Jelonek, M., Deckert, J. In search of the mRNA modification landscape in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 421 (2019).
  20. Liang, Z., Riaz, A., Chachar, S., Ding, Y., Du, H., Gu, X. Epigenetic Modifications of mRNA and DNA in Plants. Molecular Plant. 13 (1), 14-30 (2020).
  21. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  22. Meyer, K. D., et al. Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3′ UTRs and near Stop Codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  23. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m5C within archaeal mRNAs. PLoS genetics. 9 (6), 1003602 (2013).
  24. Dominissini, D., et al. The dynamic N1-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
  25. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N1-methyladenosine methylome. Nature Chemical Biology. 12 (5), 311-316 (2016).
  26. Hotchkiss, R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. Journal of Biological Chemistry. 175 (175), 315-332 (1948).
  27. Wyatt, G. R. Occurence of 5-Methyl-Cytosine in Nucleic Acids. Nature. 166, 237-238 (1950).
  28. Dubin, D. T., Taylor, R. H. The methylation state of poly A-containing- messenger RNA from cultured hamster cells. Nucleic Acids Research. 2 (10), 1653-1668 (1975).
  29. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1-16 (2017).
  30. Hussain, S., et al. NSun2-mediated cytosine-5 methylation of vault noncoding RNA determines its processing into regulatory small RNAs. Cell Reports. 4 (2), 255-261 (2013).
  31. Khoddami, V., Cairns, B. R. Identification of direct targets and modified bases of RNA cytosine methyltransferases. Nature biotechnology. 31 (5), 458-464 (2013).
  32. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  33. Yang, X., et al. 5-methylcytosine promotes mRNA export – NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27 (5), 606-625 (2017).
  34. Burgess, A., David, R., Searle, I. R. Conservation of tRNA and rRNA 5-methylcytosine in the kingdom Plantae. BMC Plant Biology. 15 (1), 199 (2015).
  35. Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing. Nucleic Acids Research. 37 (2), (2009).
  36. Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nature Genetics. 37 (8), 853-862 (2005).
  37. Auxilien, S., Guérineau, V., Szweykowska-Kulińska, Z., Golinelli-Pimpaneau, B. The human tRNA m (5) C methyltransferase Misu is multisite-specific. RNA Biology. 9 (5), 1331-1338 (2012).
  38. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
  39. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterial biofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7 (1), 41114 (2017).
  40. Huang, Y., Sheth, R. U., Kaufman, A., Wang, H. H. Scalable and cost-effective ribonuclease-based rRNA depletion for transcriptomics. Nucleic Acids Research. 48 (4), 20 (2020).
  41. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  42. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  43. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), 137 (2008).
  44. Saletore, Y., et al. The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications. Genome Biology. 13 (10), 175 (2012).
  45. Schwartz, S. Cracking the epitranscriptome. RNA. 22 (2), 169-174 (2016).
  46. Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2016).
  47. Keith, G. Mobilities of modified ribonucleotides on two-dimensional cellulose thin-layer chromatography. Biochimie. 77 (1-2), 142-144 (1995).
  48. Feederle, R., Schepers, A. Antibodies specific for nucleic acid modifications. RNA Biology. 14 (9), 1089-1098 (2017).
  49. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  50. Chen, K., et al. High-Resolution N 6 -Methyladenosine (m 6 A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m 6 A Sequencing. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).

Tags

Methylated RNA ImmunoprecipitationMeRIPRNA ModificationTranscriptomeArabidopsisRNA ExtractionGuanidine ThiocyanateAcid Phenol1-bromo-3-chloropropaneIsopropanolSodium AcetateEthanolDNaseRNA Integrity NumberIn Vitro TranscriptSonication

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (159), e61231, doi:10.3791/61231 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image