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Genetics

Essai méthylé d’immunoprécipation d’ARN pour étudier la modification m5C dans Arabidopsis

Published: May 14, 2020
doi:
10.3791/61231
, , ,
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, 2Department of Molecular Medicine, Medical School,University of Padua, 3Biologie de l’Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France

Summary

L’essai méthylé d’immunoprécipitation d’ARN est une méthode anticorps-basée employée pour enrichir pour des fragments méthylés d’ARN. Couplé à un séquençage profond, il conduit à l’identification des transcriptions portant la modification m5C.

Abstract

Les modifications secondaires de base sur l’ARN, telles que m5C, affectent la structure et la fonction des molécules modifiées d’ARN. Immunoprécipitation et séquençage de l’ARN méthylé (MeRIP-seq) est une méthode qui vise à enrichir l’ARN méthylé et, en fin de compte, à identifier les transcriptions modifiées. En bref, l’ARN sonicated est incubé avec un anticorps pour les cytosines 5-méthylées et précipité avec l’aide des perles de protéine G. Les fragments enrichis sont ensuite séquencés et les sites potentiels de méthylation sont cartographiés en fonction de la distribution des lues et de la détection maximale. MeRIP peut être appliqué à n’importe quel organisme, car il ne nécessite aucune séquence antérieure ou de modifier les connaissances enzymatiques. En outre, outre la fragmentation, l’ARN n’est soumis à aucun autre traitement chimique ou de température. Cependant, MeRIP-seq ne fournit pas de prédiction à nucléotide unique du site de méthylation comme le font d’autres méthodes, bien que la zone méthylé puisse être réduite à quelques nucléotides. L’utilisation de différents anticorps spécifiques à la modification permet à MeRIP d’être ajusté pour les différentes modifications de base présentes sur l’ARN, élargissant ainsi les applications possibles de cette méthode.

Introduction

Dans les trois royaumes de la vie, les espèces d’ARN subissent des modifications post-transcriptionnelles et la recherche sur ces modifications biochimiques fonctionnellement pertinentes est appelée « épitranscriptomics ». Epitranscriptomics est un champ en pleine croissance et diverses méthodes sont en cours de développement pour étudier et cartographier les modifications sur les molécules d’ARN (examinéesdans 1,2). Plus d’une centaine de modifications de l’ARN ont été trouvées, détectées dans les ARN, les ARN, d’autres ARNN, ainsi que dans lesARNM 3,4. Bien que la présence et la fonction de modifications post-transcriptionnelles chimiquement diverses dans les ARN et les ARNr soientlargement étudiées 5, 6,7,8,seulementrécemmentont des modifications d’ARNm ont été caractérisées. Dans les plantes, de nombreuses modifications de l’ARNm ont été identifiées à ce jour, y compris m7G à la structure du bouchon9, m1A10, hm5C11,12, et l’uridylation13. Cependant, seulement m6A10,14,15, m5C11,16,17, et pseudouridine18 ont été cartographiés transcriptome-large dans Arabidopsis. Les modifications de base post-transcriptionnelles de l’ARNm sont impliquées dans plusieurs processusde développement 19,20.

L’une des approches les plus couramment utilisées en épitranscriptomics est l’immunoprécipitation méthylé de l’ARN couplée à un séquençage profond (MeRIP-seq). MeRIP-seq a été développé en 2012 pour étudier m6A dans les cellules mammifères21,22. Il nécessite l’utilisation d’un anticorps pour la modification souhaitée et vise à enrichir pour les fragments d’ARN transportant le nucléotide modifié. Il est généralement suivi d’un séquençage profond pour identifier et cartographier les fragments enrichis ou le PCR quantitatif pour vérifier des cibles d’ARN spécifiques. L’exactitude du MeRIP est basée sur la spécificité de l’anticorps pour reconnaître le nucléotide modifié sur des modifications similaires (p. ex., m5C et hm5C11,23). Outre m6A, MeRIP-seq a également été appliqué pour étudier la méthylation del’ARNM1A et m 5 C dansplusieurs organismes 11,17,23,24,25.

La méthylation de la cytosine à la cinquième position de carbone (m5C) est la modification de l’ADN la plusrépandue 26,27 et l’une des modifications d’ARN les pluscourantes trop 3,4. Alors que m5C a été détecté dans les ARNM eucaryotes en 197528, seulement récemment ont des études axées sur la cartographie de la modification transcriptome-large, dans le codage et le non-codage ARN11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.

Les méthodes alternatives utilisées dans larecherche sur l’ARNm 5 C comprennent la conversion chimique de cytosines non méthylées en uracils (séquençage de la bisulfite) et des analyses d’immunoprécipitation basées sur une liaison irréversible d’un méthyltransferase de cytosine d’ARN connu vers ses cibles ARN (miCLIP, aza-IP). En bref, le séquençage de bisulfite exploite la caractéristique de la cytosine 5-méthylé pour être résistant au traitement de bisulfite de sodium qui désamine les cytosines non modifiées à l’uracil. La méthode a d’abord été développée pour l’ADN, mais adaptée à l’ARN aussi et de nombreuses études ont choisi cette approche pour détecter les sites m5C dansl’ARN 16,23,29,32,34,35. MiCLIP et aza-IP nécessitent des connaissances préalables sur la méthyltransferase de cytosine de l’ARN et l’utilisation de l’anticorps respectif. Dans le cas du miCLIP (méthylation individu-nucléotide-résolution de liaison croisée et immunoprécipitation), le méthyltransferase porte une mutation unique d’acide aminé de sorte qu’il se lie au substrat d’ARN mais ne peut pas êtrelibéré 30. Dans l’aza-IP (immunoprécipitation arn 5-azacytidine-médiée), la liaison irréversible est formée entre le nucléoside de 5 azaC et la méthyltransferase de cytosine d’ARN une fois exogènement fournie 5-azaC est incorporée par des polyméses d’ARN dans une molécule cibled’ARN 31.

Le principal avantage de ces trois méthodes est qu’elles permettent une cartographie unique de résolution nucléotide de m5C. En outre, miCLIP et aza-IP fournissent des informations sur les cibles spécifiques d’un méthyltransferase de cytosine d’ARN sélectionné, déchiffrant plus profondément le mécanisme et le rôle des modifications post-transcriptionnelles d’ARN. Toutefois, l’approche MeRIP-seq permet d’identifier les régions m5C à l’échelle du transcriptome sans aucune connaissance préalable requise et évite les conditions chimiques et de température difficiles, telles que le traitement de la bisulfite ou l’incubation avec 5 azaC. Le séquençage du MeRIP et de la bisulfite peut être inhibé par des structuresd’ARN secondaires 36. L’étape de fragmentation qui est incluse dans l’analyse MeRIP avant l’immunoprécipitation vise à faciliter la liaison anticorps et à augmenter la résolution del’identificationm 5 C.

Une autre méthode digne de mention est la spectrométrie de masse (SP) des nucléosides d’ARN. La SP peut détecter et distinguer tout type de modification à la fois sur l’ADN et sur l’ARN. Brièvement, l’ARN est extrait et DNase digéré, puis desalted et digéré aux nucléosides simples. Les nucléosides d’ARN sont analysés par un spectromètre de masse. Cette méthode peut être utilisée pour quantifier les niveaux de chaque modification et elle ne repose pas sur un anticorps ou une conversion chimique. Cependant, un inconvénient majeur est qu’il fournit des informations en vrac sur la présence de modifications de l’ARN. Afin de cartographier les modifications, la SP doit être combinée avec des informations sur la digestion et le séquençage de la RNase sur des molécules d’ARN spécifiques, comme dans le cas de l’ARNt humain Leu(CAA)37.

Ici, nous décrivons et discutons l’essai de MeRIP comme utilisé pour étudier la méthylationd’ARNde m 5 C dans Arabidopsis17.

Protocol

1. Préparation de l’ARN Moudre 200 mg de tissu végétaux en poudre dans de l’azote liquide, en s’assurant que le tissu reste gelé tout au long de la procédure. Extraire l’ARN du tissu végétal désiré suivant un protocole acide d’extraction de guanidinium thiocyanate-phénol-chloroforme. Pour diminuer la possibilité de contaminer l’ARN avec l’ADN pendant la séparation de phase, utilisez 1-bromo-3-chloropropane au lieu de chloroforme. Ajouter 1 mL de reagent d’extraction d’ARN contenant du thiocyanate de guanidine et du phénol acide au tissu végétal broyé (500 μL par tissu de 100 mg). Bien mélanger en inversant et assurez-vous que tous les tissus sont mouillés. Incuber pendant 10 min à température ambiante pour dissocier les complexes ribonucléoprotéines. Centrifugeuse de 10 min à 12 000 x g à 4 °C et transfert du supernatant dans un nouveau tube de 1,5 mL. Ajouter 200 μL de 1-bromo-3-chloropropane (100 μL par 500 μL de réagent d’extraction d’ARN) et vortex vigoureusement. Centrifugeuse pendant 15 min à 12 000 x g à 4 °C et transfert de la phase aqueuse supérieure (environ 500 μL) dans un nouveau tube de 1,5 mL. Ajouter 1 volume d’isopropanol (500 μL) et 0,1 volume de 3 M de pH d’acétate de sodium 5,5 (50 μL), bien mélanger en inversant et précipiter 10 min à -20 °C.REMARQUE : L’utilisation de l’acétate de sodium (NaOAc) est recommandée afin d’augmenter les précipitations d’ARN. Le protocole peut être mis en pause à ce stade en prolongeant les précipitations d’ARN pendant quelques heures ou même toute la nuit. Centrifugeuse pendant 30 min à 12 000 x g à 4 °C et jeter le supernatant. Laver la pastille deux fois avec 500 μL de 80% EtOH, centrifugeuse pendant 5 min à 12 000 x g à 4 °C et jeter. Laver la pastille une fois avec 500 μL 99% EtOH, centrifugeuse pendant 5 min à 12 000 x g à 4 °C et jeter. Sécher la pastille de 5 à 10 minutes et dissoudre en 30 μL de H2O sans RNase.REMARQUE : Utilisez plutôt n’importe quel protocole d’extraction d’ARN de choix (p. ex., un système basé sur des colonnes). Si une digestion DNase est incluse dans le protocole, sautez-la dans l’étape suivante (étape 1.3). Mesurer la concentration d’ARN (p. ex., à l’utilisation d’un spectrophotomètre) et digérer 20 μg d’ARN avec du DNase.REMARQUE : L’ADN est riche en m5C et l’anticorps ne fait pas de distinction entre l’ADN et l’ARN. Dans une réaction typique de DNase, traitez 10 μg d’ARN dans une réaction de 50 μL. Mélanger les composants suivants et incuber la réaction (s) à 37 °C pendant 30 min :10 μg d’ARN x μLTampon 10x DNase 5 μLDNase 1 μL (2 unités)H2O sans RNase jusqu’à 50 μL Retirez l’enzyme soit en ajoutant un volume approprié de réacgage d’inactivation DNase (si elle est incluse dans le kit DNase et selon les instructions du fabricant) soit en effectuant une étape de nettoyage (p. ex., purification des colonnes ou extraction de phénol/chloroforme). Vérifiez la qualité et la pureté de l’ARN isolé par électrophorèse capillaire et procédez si le numéro d’intégrité de l’ARN (RIN) est supérieur à 7, pour s’assurer que les échantillons sont de bonne qualité. FACULTATIF : Enlevez l’ARN ribosomal pour enrichir les échantillons dans la teneur en ARNm à l’aide d’un kit d’enlèvement de rRNA et selon le protocole du fabricant. Utilisez l’ARN traité par DNase de l’étape précédente pour la réaction d’épuisement rRNA(s). Effectuez plusieurs réactions si la quantité totale d’ARN est supérieure à la quantité maximale suggérée pour la réaction. Notez que seulement 5-10% de la quantité d’entrée sera récupérée après épuisement de rRNA. Procéder à l’ARN appauvri rRNA (quantité égale pour tous les échantillons) et ignorer les quantités mentionnées dans les étapes suivantes, comme ils se réfèrent à l’ARN total.REMARQUE : Pour une comparaison et une description des méthodes disponibles d’épuisement de rRNA voir références 38,39,40. rRNA est la majeure partie de l’ARN total et est m5C méthylé dans de nombreux organismes. Préparez à l’avance des transcriptions in vitro (IVT) pour être utilisées comme séquences d’ARN de contrôle et ajoutez-les dans les échantillons. Produire deux IVT distincts à l’aide d’un kit de transcription in vitro, l’un avec des nucléosides non méthylés et l’autre où le RCTP est remplacé par 5-méthyl-rCTP, pour servir de contrôles négatifs et positifs dans MeRIP, respectivement. Les transcriptions préparées étaient celles de l’EGFP et de Renilla luciferase.REMARQUE : Les IVT ne devraient pas exister dans le transcriptome de l’organisme que vous analysez. Si les IVT proviennent du même modèle (p. ex., les deux EGFP), ajoutez le contrôle positif et négatif dans deux échantillons différents. Si leur séquence est différente (p. ex., EGFP et Renilla), ils peuvent être ajoutés au même échantillon. Spike dans chaque échantillon 0,1 ng IVT par 3 μg d’ARN, comme contrôles. Sonicate l’ARN à environ 100 fragments de nt.REMARQUE : Les conditions de cisaillement de l’ARN doivent être ajustées à l’avance et elles diffèrent pour chaque sonicateur. Pour le modèle utilisé ici, la sonication est effectuée avec les conditions suivantes: Puissance de pointe 174, Facteur de service 10, Cycles /burst 200, 17 min. Sonicate la même quantité d’ARN pour tous les échantillons, au moins 12 μg d’ARN par échantillon dans 80 μL de volume total (min 60 μL, max 100 μL), rempli de H2O sans RNase. Confirmer l’efficacité de la sonication et la concentration des échantillons d’ARN par électrophoresis capillaire. La taille moyenne de l’ARN fragmenté devrait être d’environ 100 nt. 2. Immunoprécipation de l’ARN méthylé (MeRIP) Dans les tubes à faible liaison, ajouter 9 μg d’ARN sonique et H2O sans RNase jusqu’à 60 μL (ou plus, selon la concentration). Dissocier les structures secondaires en chauffant l’ARN à 70 °C dans un bain d’eau pendant 10 minutes et en refroidissant pendant 10 minutes supplémentaires dans un mélange d’eau glacée. Divisez l’échantillon en trois parties : un tiers (20 μL, si 60 μL ont été prélevés à l’étape 2.1) est enregistré dans un tube séparé à -80 °C comme échantillon d’entrée. Remplissez les 40 μL restants de H2O sans RNase jusqu’à 860 μL, puis divisez-les en deux tubes à faible liaison : un pour ip et un pour le contrôle Mock (430 μL chacun). Ajouter aux deux tubes :50 μL de tampon MeRIP 10×10 μL d’inhibiteur du RNase10 μL d’anticorps α m5C (10 μg) dans l’échantillon IP par 10 μL de H2O dans l’échantillon MockREMARQUE : Le clone d’anticorps utilisé précédemment n’est plus disponible dans le commerce. Cependant, n’importe quel anticorps monoclonal anti-5-méthylcytosine devrait fonctionner de la même manière. Les anticorps doivent être testés pour la spécificité avant d’être utilisés pour MeRIP11,23. Sceller les tubes avec du parafilm et incuber pendant 12-14 heures à 4 °C, avec rotation aérienne. Le lendemain, préparez les perles magnétiques de protéine G pour la reliure. Pour chaque tube (contrôle IP ou Mock), utilisez 40 μL de perles. Ajouter la quantité totale de perles (# de tubes x 40 μL, par exemple, pour 2 échantillons IP et 2 échantillons simulés, 160 μL de perles sont nécessaires) dans un tube de 15 mL et lavent trois fois avec 800 μL de tampon MeRIP 1x par échantillon (# de tubes x 800 tampon μL, par exemple, 3,2 mL pour 2 échantillons IP et 2 échantillons de maquettes). Effectuez des lavages à température ambiante pendant 5 min avec rotation aérienne, recueillez les perles à l’aide d’un support magnétique et jetez le tampon de lavage. Après le troisième lavage, resuspendez les perles dans le même volume de tampon MeRIP 1x que le volume initial de perles prises (# de tubes x 40 μL, par exemple, 160 μL de tampon MeRIP 1x pour 2 échantillons IP et 2 simulacres).REMARQUE : La quantité de perles de protéines G utilisées est déterminée par la capacité de liaison des perles pour le type d’anticorps spécifique et la quantité d’anticorps utilisée. Dans ce cas, les perles ont une capacité contraignante d’environ 8 μg de souris IgG par mg de perles et 30 mg/mL de concentration. Par conséquent, 40 μL sont suffisants pour lier environ 9,6 μg d’anticorps. Ajouter 40 μL de perles résuspendées à chaque échantillon IP et Mock et incuber pendant 2 heures supplémentaires à 4 °C, avec rotation aérienne. Placez les tubes sur une grille magnétique pendant 1 min et jetez le supernatant ou enregistrez-le comme un contrôle (échantillon d’ARN non lié). Lavez les perles 5 fois en réutilisant 700 μL de tampon 1x MeRIP fourni avec 0,01% de Tween 20 et en couveant pendant 10 min à température ambiante avec rotation aérienne. Resuspendez les perles lavées en 200 μL de tampon de digestion Proteinase K et ajoutez 3,5 μL de Proteinase K. Incubez pendant 3 heures à 50 °C, en secouant à 800 rpm. Parfois, feuilletez manuellement le fond du tube si un sédiment de perles se forme pendant l’incubation. Extraire l’ARN par ajout de 800 μL de reagent d’extraction d’ARN et suivre un protocole acide d’extraction de thiocyanate-phénol-chloroforme de guanidinium, et continuer comme dans l’étape 1.2. Pour augmenter la visibilité de la pastille d’ARN, un co-précipitant coloré peut être ajouté dans l’isopropanol à l’étape de précipitation. Resuspendez la pastille en 20 μL de H2O sans RNase (ou égale au volume d’entrée maintenu à l’étape 2.3). 3. Analyse en aval Soumettez les échantillons d’entrée et de propriété intellectuelle pour le séquençage à extrémité unique avec 50 bases de longueur de lecture (SE50). Coupez les adaptateurs finaux de 3′ à l’aide du cutadapt41 et jetez les lectures plus courtes que 48 nt. La carte taillée se lit sur le génome d’Arabidopsis (annotation TAIR10) à l’aide de STAR42 avec une coupure de 6 % pour les inadéquations et la taille maximale de l’intron de 10 kb. Conservez des lectures cartographiées de façon unique pour une analyse plus approfondie. Identifier les fragments d’ARN enrichis dans les échantillons de propriété intellectuelle par rapport à l’entrée à l’aide de deux méthodes distinctes et tenir compte de ceux qui sont trouvés significativement enrichis par les deux. Tout d’abord, détectez les pics MeRIP-seq à l’aide de l’appelant de pointe MACS243 sur les adresses IP poolées par rapport à l’entrée. Deuxièmement, suivez l’analyse de l’appel de pointe MeRIP-seq tel que décrit dans Meyer et coll.22 et Yang et coll.17. À l’aide de scripts R personnalisés, divisez le génome en 25 fenêtres distinctes et comptez le nombre de lectures cartographiées de façon unique pour chaque fenêtre en fonction de la position du dernier nucléotide cartographié (puisque les lectures proviennent de 100 fragments d’ARN nt). Calculer les fenêtres considérablement enrichies dans les échantillons ip par rapport à l’entrée avec le test Fisher Exact. Utilisez la procédure Benjamini-Hochberg pour corriger pour plusieurs tests. Gardez les pics considérablement enrichis qui s’étendent sur au moins deux fenêtres consécutives et jetez les pics qui ne couvrent qu’une seule fenêtre. Identifier les régions annotées du génome (transcriptions) avec des pics significativement enrichis trouvés par les deux méthodes. Alternativement ou de manière complémentaire, testez des cibles d’ARN spécifiques pour leur enrichissement dans les échantillons de propriété intellectuelle. Reverse transcrire l’ARN (même volume d’échantillons d’entrée, ip et simulacre) avec des hexamers aléatoires. Effectuez un PCR quantitatif en temps réel sur les cibles choisies, en comparant Input, IP et Mock via la méthode ΔΔCt.REMARQUE : Le produit généré ne doit pas être supérieur à 100 pb, car il s’agit de la taille moyenne de la fragmentation.

Representative Results

Un schéma de la méthode est fourni à la figure 1. Les premières étapes critiques du protocole sont d’obtenir un ARN de bonne qualité (RIN ≥ 7) et de le sonifier à environ 100 fragments de nt. L’efficacité des deux étapes est examinée par une machine d’électrophoresis capillaire à base de copeaux. Dans la figure 2A, une course représentative d’un bon échantillon d’ARN est indiquée. L’échantillon est dilué 1:10 avant chargement sur la puce afin d’avoir une concentration qui est dans la gamme de détection du kit utilisé (5-500 ng/μL). Le même échantillon est également exécuté après la sonication et est indiqué dans la figure 2B. Remarquez la présence d’un pic uniforme déplacé vers la gauche du diagramme, à une taille d’environ 100 nucléotides. La concentration plus faible est causée à la fois par la perte d’ARN pendant la fragmentation, mais aussi par l’augmentation du volume des échantillons (60-100 μL, étape 1.7.1). La qualité des échantillons IP et Mock peut être évaluée par qRT-PCR. À cette fin, les IVT à pointes servent de contrôles positifs et négatifs : l’IVT méthylé, où, dans toutes les positions cytosines il y a m5C, devrait être fortement enrichi dans l’échantillon ip; au contraire, l’IVT non méthylé ne devrait pas avoir de différence entre IP et Mock. Les amorces utilisées dans l’analyse qRT-PCR pour les deux IVTs de contrôle(EGFP et Renilla luciferase) sont répertoriées dans le tableau 1. En effet, comme le montre la figure 3, environ 80 % de l’IVT méthylé a été récupéré dans l’échantillon ip, et seulement environ 2 % dans le Simulacre. Pour le contrôle non méthylé, la récupération a été inférieure à 1 % dans les échantillons IP et Mock. Cela vérifie l’efficacité du MeRIP que les fragments d’ARN méthylés ont été précipités et enrichis, et est un bon indicateur que les échantillons peuvent être utilisés pour l’analyse en aval. En outre, l’enrichissement par pli de l’IVT non méthylé (ip/mock ratio) peut être appliqué comme seuil pour estimer l’importance de l’enrichissement dans les analyses qRT-PCR. Après avoir aligné les lectures sur le génome (figure 4), les algorithmes d’appel de pointe décrits dans les étapes 3.4.1 et 3.4.2 sont appliqués pour identifier les fenêtres statistiquement significatives, enrichies dans les échantillons de propriété intellectuelle par rapport à l’entrée. Les séquences qui correspondent à ces fenêtres peuvent être utilisées plus loin, par exemple pour rechercher des motifs conservés liés à la méthylation11,17. Figure 1 : Représentation schématique du protocole MeRIP-seq.Les échantillons d’ARN sont incubés avec un anticorps pour les cytosines 5 méthylés et les complexes sont abattus avec des perles magnétiques de protéine G qui capturent les anticorps avec l’ARN lié. Les échantillons d’ARN élucidés sont analysés par séquençage profond et qRT-PCR. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : Résultats représentatifs de l’analyse de la qualité des échantillons d’ARN.(A) Profil représentatif d’un échantillon de plante arn total qualifié. (B) Profil représentatif d’un échantillon d’ARN après sonication à 100 fragments de nt. Fichiers de sortie à partir d’un logiciel d’électrophoresis capillaire. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : analyse qRT-PCR des IVTs de contrôle.Des transcriptions in vitro méthylées et non méthylés ont été employées comme contrôles positifs et négatifs de l’essai de MeRIP, respectivement. Après immunoprécipice, l’IVT méthylé est fortement enrichi dans l’échantillon ip (vert) mais pas dans l’échantillon Mock (sans anticorps anti-m5C; violet). L’IVT non méthylé n’a montré aucun enrichissement et aucune différence entre IP et Mock. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4 : Lire l’alignement avant et après le MeRIP autour d’une transcription représentative.Lit aligné sur une transcription spécifique dans l’échantillon d’entrée (rangée supérieure) et dans deux répliques IP (rangée moyenne et inférieure). La boîte noire montre une fenêtre enrichie identifiée de 50 nt de long basée sur macs243 et MeRIP-seq22 analyses d’appel de pointe. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Cible Paire d’amorce Séquence de produit Longueur du produit EGFP (egfp) Pour: 5′- GGCAACTACAAGACCCGCCCC -3′ GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG GTGAGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC GTGAACCGCATCGAGGAAGGGC GTGAACCGCATCGAGGAAGGGC GTGAACCG 72 pb Rev: 5′- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3′ Renilla luciferase Pour: 5′- GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAAC -3′ GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACCATGTTGCCATCAAAAATCATGAGAAAGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC AGTTA 75 pb Rev: 5′- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAA -3′ Tableau 1 : Renseignements sur les amorces et les produits générés pour l’analyse qRT-PCR. Recettes tampons. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Arn porte plus d’une centaine de modifications de base distinctes4 qui forment l’épitranscriptome44. Ces modifications ajoutent une couche supplémentaire de régulation de la traduction et de la signalisation (examinéeen 5,6,8,20,45,46). Les premières études ont permis de détecter la présence de modifications post-transcriptionnelles surl’ARN 28,47, mais les ARN modifiés spécifiques doivent être identifiés afin de comprendre le rôle de l’épitranscriptomie. MeRIP a été conçu comme une méthode pour cartographier les sites de méthylation de l’ARN transcriptome-large21,22. Il peut être adapté à toute modification, si un anticorps spécifique est disponible.

La principale force de ce protocole est que c’est relativement simple, sans danger pour l’ARN et l’utilisateur (par exemple, 5-azaC est très toxique pour les plantes et les humains) et ne nécessite pas de séquence ou de modifier l’information enzymatique. En outre, l’enrichissement des ARN méthylés par la propriété intellectuelle augmente les chances de détecter de faibles ARNH abondants, contrairement au séquençage de la bisulfite qui ne contient pas d’étape d’enrichissement. Lorsque deux séries de MeRIP sont effectuées, l’enrichissement dans les fragments d’ARN contenant des sites de méthylation augmenteencore 22. Une des limitations de MeRIP, particulièrement une fois appliquée aux études de méthylation d’ARNm, est la grande quantité d’ARN exigée comme entrée pour l’essai. L’étape ribodepletion – ou poly(A) – réduira l’arrière-plan causé par l’ARN ribosomal fortement modifié, mais elle enlève plus de 90 % de l’ARN total. L’ADN doit également être complètement éliminé car il est riche en cytosines 5 méthylés. Un autre inconvénient est la résolution inférieure de la position exacte de la méthylation. La sonication de l’ARN avant l’incubation avec l’anticorps contribue à cette direction en rétrécissant la région contenant la modification à 100-200 nucléotides. Lorsque le MeRIP est combiné avec un séquençage profond, la résolution de la prédiction du site m5C augmente à mesure que les lectures de séquençage forment une distribution gaussienne autour du site potentiel de méthylation. En outre, la spécificité de l’anticorps doit être confirmée avant l’analyse (p. ex., avec des essais de taches à points d’ARN, effectués avec des oligos synthétisés avec des nucléotides modifiés), cependant, dans quelle mesure un anticorps peut effectivement faire la distinction entre des modifications étroitement liées (p. ex., m6A et m6Am) est un argument dans le domaine48,49. En outre, les ARN hautement structurés pourraient interférer avec l’interaction anticorps-antigènes, une autre restriction qui est principalement abordée avec la fragmentation et la dénaturation de l’ARN avant la propriété intellectuelle. Au contraire, le séquençage de la bisulfite, qui est également affecté par les structures secondaires, n’inclut pas d’étape de fragmentation et cela pourrait être l’une des raisons qui causent l’écart entre les sites m5C et les ARNM prédits par le séquençage de la bisulfite16 et le MeRIP-seq11,17. D’autres modifications de cytosine (p. ex., hm5C) sont également résistantes à la déamination35 à 100 mentations 24 h/24.

Les modifications apportées à MeRIP-seq comprennent une étape de liaison croisée, soit avec l’introduction d’un ribonucleoside photoactivatable (photo-crosslinking-assisté m6A-seq, PA-m6A-seq 50) ou en utilisant la lumière UV pour créer des liens croisés anticorps-ARN après l’IP (miCLIP49, méthode différente de la miCLIP décrite dans l’introduction30, mais aussi avec la résolution individu-nucléotide). À l’avenir, et à mesure que les connaissances sur la méthylation de l’ARN s’accumulent, des approches plus ciblées pourraient être préférables, basées sur les enzymes modificateurs et/ou les séquences consensuelles où la méthylation apparaît. L’identification des protéines du lecteur est essentielle à la compréhension de la fonction moléculaire et de signalisation des modifications post-transcriptionnelles. La technologie de séquençage nanopore permet déjà l’identification directe des nucléotides modifiés sans traitement préalable del’ARN 17, mais il y a encore place à l’amélioration dans ce domaine en ce qui concerne la profondeur de la séquence et l’analyse bioinformatique. Dans l’ensemble, MeRIP-seq est actuellement une approche établie, fiable et impartiale pour identifier les transcriptions de l’ARN méthylé.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été soutenus par une allocation de doctorat IMPRS à E.S., une bourse de longue durée de l’EMBO à V.P., et des fonds internes MPI-MPP à F.K. Une partie de ces travaux a également été financée par le PLAMORF, un projet qui a reçu des fonds du Conseil européen de la recherche (CER) dans le cadre du programme horizon 2020 de recherche et d’innovation de l’Union européenne (accord de subvention n° 810131). Les auteurs remercient Federico Apelt pour l’analyse bioinformatique et les commentaires sur le manuscrit, ainsi que Mathieu Bahin et Amira Kramdi pour l’analyse bioinformatique.

Materials

α‐m5C antibody ZymoResearch A3001 (discontinued), A3002 available Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available
Chip and reagents for capillary electrophoresis Agilent 5067-1511 RNA 6000 Nano kit
Dnase Ambion AM1907 TURBO DNA-free kit
Co-precipitant of nucleic acids Ambion AM9515 Glycoblue, 15 mg/mL
In vitro transcription kit Promega P1300 T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System
Low-binding reaction tubes Kisker Biotech G017 1.7 ml microcentrifuge tubes
Protein G magnetic beads Invitrogen 10003D Dynabeads Protein G
Proteinase K Ambion AM2546 20mg/mL stock solution, RNA grade
RNase inhibitor Promega N2615 RNasin Plus 40 U/μl
rRNA removal kit Epicentre RZPL11016 Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)
Sonication tubes Covaris 520045 microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm
RNA extraction reagent Ambion 15596018 TRIzol reagent
Equipment
Capillary electrophoresis machine Agilent G2939BA 2100 Bioanalyzer System
Magnetic rack Invitrogen 12321D DynaMag-2
Microentrifuge Eppendorf discontinued 5417R model
Rotator Benchmark R4040 RotoBot Mini
Sonicator Covaris 500217 S220 Focused-ultrasonicator
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONEC-W NanoDrop OneC
Waterbath GFL 1012 1012 Incubation bath
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References

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Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (159), e61231, doi:10.3791/61231 (2020).
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