JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Gemethyleerde RNA ImmunoprecipatieTest voor studie m5C Modificatie in Arabidopsis

Published: May 14, 2020
doi:
10.3791/61231
, , ,
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, 2Department of Molecular Medicine, Medical School,University of Padua, 3Biologie de l’Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France

Summary

De methylated RNA immunoprecipitation assay is een antilichaamgebaseerde methode die wordt gebruikt om te verrijken voor gemethyleerde RNA-fragmenten. In combinatie met diepe sequencing leidt het tot de identificatie van transcripties met de m5C-wijziging.

Abstract

Secundaire basisaanpassingen op RNA, zoals m5C, beïnvloeden de structuur en functie van de gemodificeerde RNA-moleculen. Methylated RNA Immunoprecipitation and sequencing (MeRIP-seq) is een methode die gericht is op het verrijken voor gemethyleerd RNA en uiteindelijk het identificeren van gewijzigde transcripties. Kort, gesoniceerd RNA wordt geïncubeerd met een antilichaam voor 5-gemethyleerde cytosines en neergeslagen met behulp van eiwit G kralen. De verrijkte fragmenten worden vervolgens gesequentieerd en de potentiële methylatielocaties worden in kaart gebracht op basis van de verdeling van de lees- en piekdetectie. MeRIP kan op elk organisme worden toegepast, omdat het geen voorafgaande sequentie of wijzigende enzymkennis vereist. Bovendien wordt RNA, naast fragmentatie, niet onderworpen aan een andere chemische of temperatuurbehandeling. MeRIP-seq biedt echter geen single-nucleotide voorspelling van de methylatieplaats zoals andere methoden doen, hoewel het gemethyleerde gebied kan worden beperkt tot een paar nucleotiden. Het gebruik van verschillende modificatiespecifieke antilichamen maakt het mogelijk om MeRIP aan te passen aan de verschillende basisaanpassingen die op RNA aanwezig zijn, waardoor de mogelijke toepassingen van deze methode worden uitgebreid.

Introduction

In alle drie de levensrijken ondergaan RNA-soorten posttranscriptomics en onderzoek naar deze functioneel relevante biochemische modificaties wordt “epitranscriptomics” genoemd. Epitranscriptomics is een groeiend gebied en er worden verschillende methoden ontwikkeld om de modificaties op RNA-moleculen te bestuderen en in kaart te brengen (beoordeeld in1,2). Er zijn meer dan honderd RNA-modificaties gevonden, gedetecteerd in rRNA’s, tRNA’s, andere nCA’s, evenals mRNA’s3,4. Hoewel de aanwezigheid en functie van chemisch diverse posttranscriptionele modificaties in tRNA’s en rRNA’s uitgebreid worden bestudeerd5,6,7,8, zijn pas onlangs mRNA-modificaties gekarakteriseerd. In installaties zijn tot op heden veel mRNA-modificaties vastgesteld, waaronder m7G aan de dopstructuur9, m1A10, hm5C11,12en uridylatie13. Echter, slechts m6A10,14,15, m5C11,16,17, en pseudouridine18 zijn in kaart gebracht transcriptoom-breed in Arabidopsis. Posttranscriptionele mRNA-basisaanpassingen zijn betrokken bij verschillende ontwikkelingsprocessen19,20.

Een van de meest gebruikte benaderingen in epitranscriptomics is de gemethyleerde RNA-immunoprecipitatie in combinatie met diepe sequencing (MeRIP-seq). MeRIP-seq werd in 2012 ontwikkeld om m6A te bestuderen in zoogdiercellen21,22. Het vereist het gebruik van een antilichaam voor de gewenste modificatie en is bedoeld om te verrijken voor RNA-fragmenten die de gemodificeerde nucleotide(s) dragen. Het wordt meestal gevolgd door diepe sequencing om de verrijkte fragmenten of kwantitatieve PCR te identificeren en in kaart te brengen om specifieke RNA-doelen te verifiëren. De nauwkeurigheid van MeRIP is gebaseerd op de specificiteit van het antilichaam om het gemodificeerde nucleotide te herkennen bij soortgelijke modificaties (bijv. m5C en hm5C11,23). Naast m6A is merip-seq ook toegepast bij de studie van m1A en m5C RNA-methylatie in verschillende organismen11,17,23,24,25.

Methylatie van het cytosine op de vijfde koolstofpositie (m5C) is de meest voorkomende DNA-modificatie26,27 en een van de meest voorkomende RNA-modificaties ook3,4. Terwijl m5C in 197528in eukaryotische mRNA ‘s werd gedetecteerd , zijn er pas recent studies gericht op het in kaart brengen van de wijziging transcriptoom-breed, in codering en niet-coderen RNAs11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.

Alternatieve methoden die worden gebruikt in m5C RNA-onderzoek omvatten chemische omzetting van niet-gemethyleerde cytosines in uracils (bisulfietsequentie) en immunoprecipitatietests op basis van een onomkeerbare binding van een bekend RNA cytosine methyltransferase aan zijn RNA-doelen (miCLIP, aza-IP). Kortom, bisulfiet sequencing maakt gebruik van het kenmerk van 5-gemethyleerde cytosine om resistent te zijn tegen natriumbisulfietbehandeling die ongewijzigde cytosines deaminates tot uracil. De methode werd eerst ontwikkeld voor DNA, maar ook aangepast voor RNA en veel studies hebben voor deze aanpak gekozen om m5C-locaties in RNA16,23,29,32,34,35te detecteren . Zowel miCLIP als aza-IP vereisen voorkennis van het RNA cytosine methyltransferase en het gebruik van het betreffende antilichaam. In het geval van miCLIP (methylatie individual-nucleotide-resolution crosslinking en immunoprecipitation) draagt het methyltransferase één aminozuurmutatie zodat het zich bindt aan het RNA-substraat, maar niet kan worden vrijgegeven30. In aza-IP (5-azacytidine-gemedieerde RNA-immunoprecipitatie) wordt de onomkeerbare binding gevormd tussen de 5-azaC-nucleoside en de RNA-cytosinemethyltransferase wanneer exogeen geleverde 5-azaC wordt opgenomen door RNA-polymerases in een doel-RNA-molecuul31.

Het belangrijkste voordeel van deze drie methoden is dat ze een enkele nucleotideresolutietoewijzing van m5C mogelijk maken. Daarnaast geven miCLIP en aza-IP informatie over de specifieke doelen van een geselecteerd RNA cytosine methyltransferase, waardoor het mechanisme en de rol van posttranscriptionele RNA-modificaties dieper worden ontcijferd. De MeRIP-seq-benadering kan echter transcriptoombrede m5C-regio’s identificeren zonder enige vereiste voorkennis en vermijdt zware chemische en temperatuuromstandigheden, zoals bisulfietbehandeling of incubatie met 5-azaC. Zowel MeRIP als bisulfiet sequencing kunnen worden geremd door secundaire RNA-structuren36. De fragmentatiestap die voorafgaand aan immunoprecipitatie in de MeRIP-test is opgenomen, heeft tot doel de binding van antilichamen te vergemakkelijken en de resolutie van m5C-identificatie te verhogen.

Een andere methode die het vermelden waard is, is massaspectrometrie (MS) van RNA-nucleosiden. MS kan elk type wijziging detecteren en onderscheiden, zowel op DNA als op RNA. Kort, RNA wordt geëxtraheerd en DNase verteerd, vervolgens ontzout en verteerd tot enkele nucleosiden. De RNA-nucleosiden worden geanalyseerd door een massaspectrometer. Deze methode kan worden gebruikt om de niveaus van elke wijziging te kwantificeren en is niet afhankelijk van een antilichaam of een chemische omzetting. Een groot nadeel is echter dat het bulkinformatie biedt over de aanwezigheid van RNA-wijzigingen. Om de wijzigingen in kaart te brengen, moet MS worden gecombineerd met RNase-vergisting en sequencing-informatie over specifieke RNA-moleculen, zoals in het geval van humaan tRNALeu(CAA)37.

Hier beschrijven en bespreken we de MeRIP-test zoals gebruikt om m5C RNA-methylatie in Arabidopsis17te bestuderen.

Protocol

1. Het RNA voorbereiden Maal 200 mg plantenweefsel tot poeder in vloeibare stikstof en zorg ervoor dat het weefsel gedurende de hele procedure bevroren blijft. Haal het RNA uit het gewenste plantenweefsel na een zuur guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform extractieprotocol. Gebruik 1-bromo-3-chloropropaan in plaats van chloroform om de kans te verkleinen om RNA met DNA te vervuilen tijdens de fasescheiding. Voeg 1 ml RNA-extractiereagens met guanidinethocyanaat en zuurfenol toe aan het gemalen plantenweefsel (500 μL per 100 mg weefsel). Meng goed door om te wenden en zorg ervoor dat al het weefsel nat is. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om de ribonucleoproteïnecomplexen te scheiden. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C en breng het supernatant over in een nieuwe buis van 1,5 ml. Voeg 200 μL 1-bromo-3-chloropropaan (100 μL per 500 μL RNA extractiereagens) en vortex krachtig toe. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C en breng de bovenste waterige fase (ca. 500 μL) over in een nieuwe buis van 1,5 ml. Voeg 1 volume isopropanol (500 μL) en 0,1 volume van 3 M natriumacetaat pH 5,5 (50 μL) toe, meng goed door 10 min bij -20 °C om te draaien en neer te storten.OPMERKING: Het gebruik van natriumacetaat (NaOAc) wordt aanbevolen om RNA-neerslag te verbeteren. Het protocol kan op dit punt worden onderbroken door de neerslag van RNA met een paar uur of zelfs ‘s nachts te verlengen. Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Was de pellet tweemaal met 500 μL van 80% EtOH, centrifugeer gedurende 5 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C en gooi het weg. Was de pellet eenmaal met 500 μL 99% EtOH, centrifugeer gedurende 5 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C en gooi het weg. Droog de pellet gedurende 5-10 minuten en los op in 30 μL RNase-vrije H2O.OPMERKING: Gebruik in plaats daarvan elk RNA-extractieprotocol naar keuze (bijvoorbeeld een op kolommen gebaseerd systeem). Als een DNase-vergisting in het protocol is opgenomen, slaat u deze over in de volgende stap (stap 1.3). Meet de RNA-concentratie (bijv. met behulp van een spectrofotometer) en verteerd 20 μg RNA met DNase.OPMERKING: DNA is rijk aan m5C en het antilichaam maakt geen onderscheid tussen DNA en RNA. Behandel bij een typische DNase-reactie 10 μg RNA in een reactie van 50 μL. Meng de volgende componenten en incubeer de reactie(s) gedurende 30 minuten bij 37 °C:10 μg RNA x μL10x DNase buffer 5 μLDNase 1 μL (2 eenheden)RNase-vrije H2O tot 50 μL Verwijder het enzym door een passend volume DNase-inactiveringsreagens toe te voegen (als het is opgenomen in de DNase-kit en volgens de instructies van de fabrikant) of door een opruimstap uit te voeren (bijv. kolomzuivering of fenol/chloroformextractie). Controleer de kwaliteit en zuiverheid van het geïsoleerde RNA door capillaire elektroforese en ga verder als het RNA-integriteitsnummer (RIN) hoger is dan 7, om ervoor te zorgen dat de monsters van goede kwaliteit zijn. OPTIONEEL: Verwijder het ribosomale RNA om de monsters in mRNA-inhoud te verrijken met behulp van een rRNA-verwijderingskit en volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik het met DNase behandelde RNA uit de vorige stap voor de rRNA-depletiereactie(s). Voer meerdere reacties uit als de hoeveelheid totaal RNA groter is dan het maximale bedrag dat voor de reactie wordt voorgesteld. Houd er rekening mee dat slechts 5-10% van het invoerbedrag wordt teruggevorderd na rRNA-uitputting. Ga verder met het rRNA-uitgeputte RNA (gelijke hoeveelheid voor alle monsters) en negeer de bedragen die in de volgende stappen worden vermeld, omdat ze verwijzen naar het totale RNA.OPMERKING: Voor een vergelijking en beschrijving van de beschikbare rRNA-uitputtingsmethoden zie referenties 38,39,40. rRNA is het grootste deel van totaal RNA en is m5C gemethyleerd in veel organismen. Bereid vooraf in vitro transcripties (IVT) voor die moeten worden gebruikt als controle-RNA-sequenties en voeg ze toe aan de monsters. Produceer twee verschillende IVT’s met behulp van een in vitro transcriptiekit, een met niet-gemethyleerde nucleosiden en een waarbij rCTP wordt vervangen door 5-methyl-rCTP, om respectievelijk als negatieve en positieve controles in MeRIP te dienen. De opgestelde transcripties waren die van EGFP en Renilla luciferase.OPMERKING: De IVT’s mogen niet bestaan in het transcriptoom van het organisme dat u analyseert. Als de IVT’s uit dezelfde sjabloon komen (bijv. beide EGFP), voeg dan de positieve en negatieve controle toe in twee verschillende monsters. Als hun volgorde anders is (bijv. EGFP en Renilla), kunnen ze aan hetzelfde monster worden toegevoegd. Piek in elk monster 0,1 ng IVT per 3 μg RNA, als controle. Soniceer het RNA tot ongeveer 100 nt fragmenten.OPMERKING: De voorwaarden voor RNA-afschuiving moeten van tevoren worden aangepast en verschillen per sonicator. Voor het hier gebruikte model wordt sonicatie uitgevoerd onder de volgende omstandigheden: Piekvermogen 174, Duty factor 10, Cycles/burst 200, 17 min. Soniceer dezelfde hoeveelheid RNA voor alle monsters, ten minste 12 μg RNA per monster in 80 μL van het totale volume (min 60 μL, max 100 μL), gevuld met RNase-vrije H2O. Bevestig de efficiëntie van sonicatie en de concentratie van de RNA-monsters door capillaire elektroforese. De gemiddelde grootte van gefragmenteerd RNA moet ongeveer 100 nt zijn. 2. Gemethyleerde RNA Immunoprecipatie (MeRIP) Voeg in laagbindende buizen 9 μg gesoniceerd RNA en RNase-vrij H2O toe tot 60 μL (of meer, afhankelijk van de concentratie). Dissocieer de secundaire structuren door het RNA gedurende 10 minuten op 70 °C in een waterbad te verwarmen en nog eens 10 minuten af te koelen in een ijswatermix. Splits het monster in drie delen: een derde (20 μL, als 60 μL in stap 2.1 is genomen) wordt opgeslagen in een aparte buis bij -80 °C als inputmonster. Vul de resterende 40 μL met RNase-vrije H2O tot 860 μL en splits vervolgens in twee laagbindende buizen: één voor IP en één voor de Mock-regeling (elk 430 μL). Voeg aan beide buizen toe:50 μL 10x MeRIP buffer10 μL RNase-remmer10 μL α-m5C antilichaam (10 μg) in het IP-monster per 10 μL H2O in het Mock-monsterOPMERKING: De eerder gebruikte antilichaamkloon is niet meer in de handel verkrijgbaar. Echter, elke anti-5-methylcytosine monoklonale antilichaam moet op dezelfde manier werken. Antilichamen moeten op specificiteit worden getest voordat ze voor MeRIP11,23worden gebruikt . Sluit de buizen af met parafilm en broed gedurende 12-14 uur bij 4 °C, met overheadrotatie. Bereid de volgende dag het eiwit G magnetische kralen voor op binding. Gebruik voor elke buis (IP- of Mock control) 40 μL kralen. Voeg de totale hoeveelheid kralen toe (# van buizen x 40 μL, voor 2 IP- en 2 Mock-monsters is bijvoorbeeld 160 μL kralen nodig) in een buis van 15 ml en was drie keer met 800 μL 1x MeRIP-buffer per monster (# van buizen x 800 μL-buffer, bijv. 3,2 ml voor 2 IP- en 2 mockmonsters). Voer wasbeurten uit op kamertemperatuur gedurende 5 minuten met overheadrotatie, verzamel de kralen met behulp van een magnetisch rek en gooi de wasbuffer weg. Na de derde wasbeurt worden de kralen opnieuw uitgegeven in hetzelfde volume van 1x MeRIP-buffer als het oorspronkelijke volume genomen kralen (# van buizen x 40 μL, bijvoorbeeld 160 μL 1x MeRIP-buffer voor 2 IP- en 2 Mock-monsters).OPMERKING: De hoeveelheid eiwit G-kralen die wordt gebruikt, wordt bepaald door de bindingscapaciteit van de kralen voor het specifieke antilichaamtype en de hoeveelheid gebruikt antilichaam. In dit geval hebben de kralen een bindingscapaciteit van ca. 8 μg muis IgG per mg kralen en 30 mg/ml concentratie. Daarom is 40 μL voldoende om ongeveer 9,6 μg antilichaam te binden. Voeg 40 μL geresuspendeerde kralen toe aan elk IP- en Mock-monster en incuber gedurende nog eens 2 uur bij 4 °C, met overheadrotatie. Plaats de buizen gedurende 1 minuut op een magnetisch rek en gooi het supernatant weg of bewaar het als controlemiddel (niet-gebonden RNA-monster). Was de kralen 5 keer door opnieuw te gebruiken in 700 μL 1x MeRIP-buffer geleverd met 0,01% Tween 20 en 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur met overheadrotatie. Resuspendpend de gewassen kralen in 200 μL van Proteinase K spijsverteringsbuffer en voeg 3,5 μL Proteinase K toe. Incubeert gedurende 3 uur bij 50 °C, schuddend bij 800 tpm. Veeg af en toe handmatig op de bodem van de buis als zich tijdens de incubatie een sediment van kralen vormt. Extracteer het RNA door toevoeging van 800 μL RNA-extractiereagens en volgens een zuur guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform extractieprotocol, en ga verder zoals in stap 1.2. Om de zichtbaarheid van de RNA-pellet te vergroten, kan bij de neerslagstap een gekleurd coprecipitant in isopropanol worden toegevoegd. Resuspendeer de pellet in 20 μL RNase-vrije H2O (of gelijk aan ingangsvolume in stap 2.3). 3. Downstream-analyse Dien de invoer- en IP-monsters in voor sequencing met één uiteinde met een leeslengte van 50 bases (SE50). Trim 3’ eindadapters met cutadapt41 en gooi leeswaarden weg die korter zijn dan 48 nt. Kaart bijgesneden leest naar het Arabidopsis genoom (TAIR10 annotatie) met behulp van STAR42 met een cutoff van 6% voor mismatches en maximale intron grootte van 10 kb. Houd uniek in kaart gebrachte leesbewerkingen voor verdere analyse. Identificeer verrijkte RNA-fragmenten in IP-monsters in vergelijking met Input met behulp van twee verschillende methoden en overweeg de methoden die door beide aanzienlijk zijn verrijkt. Detecteer eerst MeRIP-seq-pieken met MACS2-piekbeller43 op gepoolde IPs versus Invoer. Ten tweede, volg de analyse voor MeRIP-seq peak calling zoals beschreven in Meyer et al.22 en Yang et al.17. Met behulp van aangepaste R-scripts verdeelt u het genoom in verschillende 25 nt-vensters en telt u het aantal uniek toegewezen leesbewerkingen voor elk venster op basis van de positie van het laatst toegewezen nucleotide (omdat de leesbewerkingen afkomstig zijn van 100 nt RNA-fragmenten). Bereken aanzienlijk verrijkte vensters in IP-monsters in vergelijking met Input met de Fisher Exact Test. Gebruik de Benjamini-Hochberg procedure om te corrigeren voor meerdere tests. Bewaar de aanzienlijk verrijkte pieken die zich over ten minste twee opeenvolgende vensters uitstrekken en gooi pieken weg die slechts één venster bedekken. Identificeer geannoteerde gebieden van het genoom (transcripties) met aanzienlijk verrijkte pieken die door beide methoden worden gevonden. U ook of complementair specifieke RNA-streefcijfers testen op hun verrijking in de IP-monsters. Transcriber het RNA (zelfde volume input-, IP- en mockmonsters) met willekeurige hexameren. Voer kwantitatieve real-time PCR uit op de gekozen doelen en vergelijk Input, IP en Mock via de ΔΔCt-methode.OPMERKING: Het gegenereerde product mag niet langer zijn dan 100 bp, omdat dit de gemiddelde fragmentatiegrootte is.

Representative Results

Een schema van de methode is opgenomen in figuur 1. De eerste kritieke stappen van het protocol zijn het verkrijgen van RNA van goede kwaliteit (RIN ≥ 7) en het soniceren tot ongeveer 100 nt fragmenten. De efficiëntie van beide stappen wordt onderzocht door een capillaire elektroforesemachine op basis van chips. In figuur 2Awordt een representatieve run van een goed RNA-monster weergegeven. Het monster wordt 1:10 verdund voordat het op de chip wordt geladen om een concentratie te hebben die binnen het detectiebereik van de gebruikte kit ligt (5-500 ng/μL). Hetzelfde monster wordt ook uitgevoerd na sonicatie en wordt weergegeven in figuur 2B. Merk op dat de aanwezigheid van een uniforme piek naar links van het diagram is verschoven, met een grootte van ongeveer 100 nucleotiden. De lagere concentratie wordt veroorzaakt door verlies van RNA tijdens fragmentatie, maar ook door het toegenomen volume van de monsters (60-100 μL, stap 1.7.1). De kwaliteit van de IP- en Mock-samples kan worden beoordeeld door qRT-PCR. Hiertoe dienen de in een piek opgenomen IVT’s als positieve en negatieve controles: het gemethyleerde IVT, waar in alle cytosineposities m5C is, zal naar verwachting sterk worden verrijkt in het IP-monster; integendeel, het niet-gemethyleerde IVT mag geen verschil hebben tussen IP en Mock. De primers die worden gebruikt in de qRT-PCR-test voor de twee controle-IVT ‘s (EGFP en Renilla luciferase) zijn vermeld in tabel 1. Zoals blijkt uit figuur 3,werd ongeveer 80% van het gemethyleerde IVT teruggevonden in het IP-monster en slechts ongeveer 2% in de Mock. Voor de niet-gemethyleerde controle was het herstel lager dan 1% in zowel IP- als Mock-monsters. Dit controleert de efficiëntie van MeRIP dat gemethyleerde RNA-fragmenten zijn neergeslagen en verrijkt, en is een goede indicator dat de monsters kunnen worden gebruikt voor downstream-analyse. Bovendien kan de vouwverrijking van het niet-gemethyleerde IVT (IP-mock ratio) worden toegepast als een drempel om de significantie van verrijking in de qRT-PCR-tests te schatten. Na het uitlijnen van de aflezingen op het genoom (figuur 4), worden de piekaanroepende algoritmen die in stap 3.4.1 en 3.4.2 worden beschreven, toegepast om de statistisch significante vensters te identificeren, verrijkt in de IP-monsters in vergelijking met de input. De sequenties die overeenkomen met deze vensters kunnen verder worden gebruikt, bijvoorbeeld om te zoeken naar geconserveerde methylatiegerelateerdemotieven 11,17. Figuur 1: Schematische weergave van het MeRIP-seq-protocol.RNA-monsters worden geïncubeerd met een antilichaam voor 5-gemethyleerde cytosines en de complexen worden naar beneden getrokken met eiwit G magnetische kralen die de antilichamen samen met het gebonden RNA vangen. De eluted RNA monsters worden geanalyseerd door diepe sequencing en qRT-PCR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Representatieve resultaten van kwaliteitsanalyse van RNA-monsters.(A) Representatief profiel van een gekwalificeerd totaal RNA-plantenmonster. (B) Representatief profiel van een RNA-monster na sonicatie tot 100 nt fragmenten. Uitvoerbestanden van capillaire elektroforesesoftware. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: qRT-PCR-analyse van controle-IVT’s.Gemethyleerde en niet-gemethyleerde in vitro transcripties werden respectievelijk gebruikt als positieve en negatieve controles van de MeRIP-test. Na immunoprecipitatie is het gemethyleerde IVT sterk verrijkt in het IP-monster (groen) maar niet in het Mock-monster (zonder anti-m5C antilichaam; paars). Het niet-gemethyleerde IVT vertoonde geen verrijking en geen verschil tussen IP en Mock. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Lees de uitlijning voor en na MeRIP rond een representatief transcript.Leest uitgelijnd op een specifiek transcript in het invoervoorbeeld (bovenste rij) en in twee IP-replica’s (middelste en onderste rij). De zwarte doos toont een geïdentificeerd verrijkt 50 nt lang venster op basis van MACS243 en MeRIP-seq22 peak-calling analyses. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Doel Primerpaar Productvolgorde Productlengte EGFP Voor: 5′- GGCAACTACAAGACCCGCGCC -3′ GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC 72 bp Herz: 5′- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3′ Luciferase van Renilla Voor: 5′- GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAAC -3′ GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACCATGTTGCCATCAAAAATCATGAGAAAGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC 75 bp Rev: 5′- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAA -3’ Tabel 1: Informatie over de primers en gegenereerde producten voor de qRT-PCR-analyse. Buffer recepten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

RNA draagt meer dan honderd verschillende basisaanpassingen4 die epitranscriptome44vormen. Deze wijzigingen voegen een extra regellaag van vertaling en signalering toe (herzien in5,6,8,20,45,46). Vroege studies waren in staat om de aanwezigheid van post-transcriptionele modificaties op RNA28,47 tedetecteren,maar de specifieke gewijzigde RNA’s moeten worden geïdentificeerd om de rol van epitranscriptomics te begrijpen. MeRIP is ontworpen als een methode om RNA-methylatielocaties transcriptoombreed21,22in kaart te brengen . Het kan worden aangepast aan elke wijziging, als er een specifiek antilichaam beschikbaar is.

De belangrijkste kracht van dit protocol is dat is relatief eenvoudig, veilig voor het RNA en de gebruiker (bijv. 5-azaC is zeer giftig voor planten en mensen) en vereist geen sequentie of wijziging van enzyminformatie. Bovendien vergroot de verrijking van gemethyleerde RNA’s door het OT de kans op lage overvloedige mRNA’s die moeten worden gedetecteerd, in tegenstelling tot bisulfietsequenties die geen verrijkingsstap bevatten. Wanneer twee seriële rondes van MeRIP worden uitgevoerd, neemt de verrijking in RNA-fragmenten die methylatieplaatsen bevatten verder toe22. Een van de beperkingen van MeRIP, vooral wanneer toegepast op mRNA-methylatiestudies, is de hoge hoeveelheid RNA die nodig is als input voor de test. De ribodepletie – of poly(A) verrijking – stap zal de achtergrond veroorzaakt door het sterk gewijzigde ribosomale RNA verminderen, maar het verwijdert meer dan 90% van het totale RNA. DNA moet ook volledig worden verwijderd omdat het rijk is aan 5-gemethyleerde cytosines. Een ander nadeel is de lagere resolutie van de exacte positie van methylatie. Sonicatie van het RNA voorafgaand aan incubatie met het antilichaam helpt in deze richting door het gebied met de wijziging te beperken tot 100-200 nucleotiden. Wanneer MeRIP wordt gecombineerd met diepe sequencing, neemt de resolutie van m5C-sitevoorspelling toe naarmate de sequencing-lectuur een Gaussiaanse verdeling rond de potentiële methylatiesite vormt. Bovendien moet de specificiteit van het antilichaam vóór de test worden bevestigd (bv. met RNA dot blot-tests, uitgevoerd met oligo’s gesynthetiseerd met gemodificeerde nucleotiden), maar in hoeverre een antilichaam daadwerkelijk onderscheid kan maken tussen nauw verwante wijzigingen (bijv. m6A en m6Am) is een argument in veld48,49. Bovendien kunnen sterk gestructureerde RNA’s interfereren met de interactie tussen antilichamen en antigeen, een andere beperking die meestal wordt aangepakt met fragmentatie en denaturatie van RNA vóór IP. Integendeel, bisulfietsequenties die ook door secundaire structuren worden beïnvloed, omvatten geen fragmentatiestap en dit kan een reden zijn die discrepantie veroorzaakt tussen de m5C-locaties en mRNA ‘s die worden voorspeld door bisulfietsequentie16 en MeRIP-seq11,17. Andere cytosine modificaties (bijv. hm5C) zijn ook resistent tegen bisulfietgemedieerde deaminatie35.

Wijzigingen van MeRIP-seq omvatten een crosslinkingstap, hetzij met de introductie van een fotoactiveerbare ribonucleoside (photo-crosslinking-assisted m6A-seq, PA-m6A-seq 50) of met behulp van UV-licht om antilichaam-RNA-crosslinks te creëren na het IP (miCLIP49, andere methode dan de miCLIP beschreven in inleiding30, maar ook met individuele nucleotideresolutie). In de toekomst, en naarmate de kennis over RNA-methylatie zich ophoopt, kunnen meer gerichte benaderingen de voorkeur hebben, op basis van de wijzigende enzymen en/of de consensussequenties waar methylatie verschijnt. De identificatie van lezereiwitten is essentieel voor het begrip van de moleculaire en signalerende functie van posttranscriptionele wijzigingen. Nanopore sequencing technologie maakt het al mogelijk om gemodificeerde nucleotiden direct te identificeren zonder voorafgaande behandeling van het RNA17, maar er is nog ruimte voor verbetering op dit gebied met betrekking tot sequentiediepte en bioinformatische analyse. Over het algemeen is MeRIP-seq momenteel een gevestigde, betrouwbare en onbevooroordeelde benadering om gemethyleerde RNA-transcripties te identificeren.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door een IMPRS PhD stipendium voor E.S, een EMBO Long-Term Fellowship to V.P., en MPI-MPP interne fondsen voor F.K. Een deel van dit werk werd ook gefinancierd via PLAMORF, een project dat financiering heeft ontvangen van de European Research Council (ERC) in het kader van het Horizon 2020 onderzoek- en innovatieprogramma van de Europese Unie (Subsidieovereenkomst nr. 810131). De auteurs willen Federico Apelt bedanken voor de bioinformatische analyse en commentaar op het manuscript, en Mathieu Bahin en Amira Kramdi voor de bioinformatische analyse.

Materials

α‐m5C antibody ZymoResearch A3001 (discontinued), A3002 available Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available
Chip and reagents for capillary electrophoresis Agilent 5067-1511 RNA 6000 Nano kit
Dnase Ambion AM1907 TURBO DNA-free kit
Co-precipitant of nucleic acids Ambion AM9515 Glycoblue, 15 mg/mL
In vitro transcription kit Promega P1300 T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System
Low-binding reaction tubes Kisker Biotech G017 1.7 ml microcentrifuge tubes
Protein G magnetic beads Invitrogen 10003D Dynabeads Protein G
Proteinase K Ambion AM2546 20mg/mL stock solution, RNA grade
RNase inhibitor Promega N2615 RNasin Plus 40 U/μl
rRNA removal kit Epicentre RZPL11016 Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)
Sonication tubes Covaris 520045 microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm
RNA extraction reagent Ambion 15596018 TRIzol reagent
Equipment
Capillary electrophoresis machine Agilent G2939BA 2100 Bioanalyzer System
Magnetic rack Invitrogen 12321D DynaMag-2
Microentrifuge Eppendorf discontinued 5417R model
Rotator Benchmark R4040 RotoBot Mini
Sonicator Covaris 500217 S220 Focused-ultrasonicator
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONEC-W NanoDrop OneC
Waterbath GFL 1012 1012 Incubation bath
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trixl, L., Lusser, A. The dynamic RNA modification 5-methylcytosine and its emerging role as an epitranscriptomic mark. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), 1-17 (2019).
  2. Mongan, N. P., Emes, R. D., Archer, N. Detection and analysis of RNA methylation. F1000Research. 8, 559 (2019).
  3. Cantara, W. A., et al. The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update. Nucleic Acids Research. 39, 195-201 (2011).
  4. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (1), 303-307 (2018).
  5. Agris, P. F. Bringing order to translation: the contributions of transfer RNA anticodon-domain modifications. EMBO reports. 9 (7), 629-635 (2008).
  6. Chow, C. S., Lamichhane, T. N., Mahto, S. K. Expanding the Nucleotide Repertoire of the Ribosome with Post-Transcriptional Modifications. ACS Chemical Biology. 2 (9), 610-619 (2007).
  7. Gigova, A., Duggimpudi, S., Pollex, T., Schaefer, M., Koš, M. A cluster of methylations in the domain IV of 25S rRNA is required for ribosome stability. RNA. 20 (10), 1632-1644 (2014).
  8. Motorin, Y., Helm, M. tRNA Stabilization by Modified Nucleotides. Biochemistry. 49 (24), 4934-4944 (2010).
  9. Shatkin, A. Capping of eucaryotic mRNAs. Cell. 9 (4), 645-653 (1976).
  10. Shen, L., et al. N 6 -Methyladenosine RNA Modification Regulates Shoot Stem Cell Fate in Arabidopsis. Developmental Cell. 38 (2), 186-200 (2016).
  11. Cui, X., et al. 5-Methylcytosine RNA Methylation in Arabidopsis Thaliana. Molecular Plant. 10 (11), 1387-1399 (2017).
  12. Huber, S. M., et al. Formation and abundance of 5-hydroxymethylcytosine in RNA. ChemBioChem. 16 (5), 752-755 (2015).
  13. Zuber, H., et al. Uridylation and PABP Cooperate to Repair mRNA Deadenylated Ends in Arabidopsis. Cell Reports. 14 (11), 2707-2717 (2016).
  14. Luo, G. Z., et al. Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana. Nature Communications. 5 (1), 5630 (2014).
  15. Wan, Y., et al. Transcriptome-wide high-throughput deep m6A-seq reveals unique differential m6A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana. Genome Biology. 16 (1), 1-26 (2015).
  16. David, R., et al. Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs. The Plant Cell. 29 (3), 445-460 (2017).
  17. Yang, L., et al. m5C Methylation Guides Systemic Transport of Messenger RNA over Graft Junctions in Plants. Current Biology. 29 (15), 2465-2476 (2019).
  18. Sun, L., et al. Transcriptome-wide analysis of pseudouridylation of mRNA and non-coding RNAs in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 70 (19), 5089 (2019).
  19. Chmielowska-Bąk, J., Arasimowicz-Jelonek, M., Deckert, J. In search of the mRNA modification landscape in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 421 (2019).
  20. Liang, Z., Riaz, A., Chachar, S., Ding, Y., Du, H., Gu, X. Epigenetic Modifications of mRNA and DNA in Plants. Molecular Plant. 13 (1), 14-30 (2020).
  21. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  22. Meyer, K. D., et al. Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3′ UTRs and near Stop Codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  23. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m5C within archaeal mRNAs. PLoS genetics. 9 (6), 1003602 (2013).
  24. Dominissini, D., et al. The dynamic N1-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
  25. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N1-methyladenosine methylome. Nature Chemical Biology. 12 (5), 311-316 (2016).
  26. Hotchkiss, R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. Journal of Biological Chemistry. 175 (175), 315-332 (1948).
  27. Wyatt, G. R. Occurence of 5-Methyl-Cytosine in Nucleic Acids. Nature. 166, 237-238 (1950).
  28. Dubin, D. T., Taylor, R. H. The methylation state of poly A-containing- messenger RNA from cultured hamster cells. Nucleic Acids Research. 2 (10), 1653-1668 (1975).
  29. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1-16 (2017).
  30. Hussain, S., et al. NSun2-mediated cytosine-5 methylation of vault noncoding RNA determines its processing into regulatory small RNAs. Cell Reports. 4 (2), 255-261 (2013).
  31. Khoddami, V., Cairns, B. R. Identification of direct targets and modified bases of RNA cytosine methyltransferases. Nature biotechnology. 31 (5), 458-464 (2013).
  32. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  33. Yang, X., et al. 5-methylcytosine promotes mRNA export – NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27 (5), 606-625 (2017).
  34. Burgess, A., David, R., Searle, I. R. Conservation of tRNA and rRNA 5-methylcytosine in the kingdom Plantae. BMC Plant Biology. 15 (1), 199 (2015).
  35. Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing. Nucleic Acids Research. 37 (2), (2009).
  36. Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nature Genetics. 37 (8), 853-862 (2005).
  37. Auxilien, S., Guérineau, V., Szweykowska-Kulińska, Z., Golinelli-Pimpaneau, B. The human tRNA m (5) C methyltransferase Misu is multisite-specific. RNA Biology. 9 (5), 1331-1338 (2012).
  38. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
  39. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterial biofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7 (1), 41114 (2017).
  40. Huang, Y., Sheth, R. U., Kaufman, A., Wang, H. H. Scalable and cost-effective ribonuclease-based rRNA depletion for transcriptomics. Nucleic Acids Research. 48 (4), 20 (2020).
  41. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  42. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  43. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), 137 (2008).
  44. Saletore, Y., et al. The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications. Genome Biology. 13 (10), 175 (2012).
  45. Schwartz, S. Cracking the epitranscriptome. RNA. 22 (2), 169-174 (2016).
  46. Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2016).
  47. Keith, G. Mobilities of modified ribonucleotides on two-dimensional cellulose thin-layer chromatography. Biochimie. 77 (1-2), 142-144 (1995).
  48. Feederle, R., Schepers, A. Antibodies specific for nucleic acid modifications. RNA Biology. 14 (9), 1089-1098 (2017).
  49. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  50. Chen, K., et al. High-Resolution N 6 -Methyladenosine (m 6 A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m 6 A Sequencing. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).

Tags

Methylated RNA ImmunoprecipitationMeRIPRNA ModificationTranscriptomeArabidopsisRNA ExtractionGuanidine ThiocyanateAcid Phenol1-bromo-3-chloropropaneIsopropanolSodium AcetateEthanolDNaseRNA Integrity NumberIn Vitro TranscriptSonication

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (159), e61231, doi:10.3791/61231 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image