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Genetics

Ensayo de inmunoprecipitación de ARN metilado para estudiar la modificación m5C en Arabidopsis

Published: May 14, 2020
doi:
10.3791/61231
, , ,
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, 2Department of Molecular Medicine, Medical School,University of Padua, 3Biologie de l’Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France

Summary

El ensayo de inmunoprecipitación de ARN metilado es un método basado en anticuerpos utilizado para enriquecer fragmentos de ARN metilados. Junto con la secuenciación profunda, conduce a la identificación de transcripciones que llevan la modificación m5C.

Abstract

Las modificaciones de base secundarias en el ARN, como m5C, afectan a la estructura y función de las moléculas modificadas de ARN. Inmunoprecipitación y secuenciación de ARN metilado (MeRIP-seq) es un método que tiene como objetivo enriquecer el ARN metilado y, en última instancia, identificar transcripciones modificadas. Brevemente, el ARN sonicado se incuba con un anticuerpo para citosinas metiladas de 5 y se precipita con la ayuda de cuentas G proteicas. A continuación, los fragmentos enriquecidos se secuencian y los sitios potenciales de metilación se asignan en función de la distribución de las lecturas y la detección de picos. MeRIP se puede aplicar a cualquier organismo, ya que no requiere ninguna secuencia previa o modificar el conocimiento enzimático. Además, además de la fragmentación, el ARN no se somete a ningún otro tratamiento químico o de temperatura. Sin embargo, MeRIP-seq no proporciona predicción de nucleótidos únicos del sitio de metilación como otros métodos, aunque el área metilada se puede reducir a unos pocos nucleótidos. El uso de diferentes anticuerpos específicos de modificación permite ajustar MeRIP para las diferentes modificaciones de base presentes en el ARN, ampliando las posibles aplicaciones de este método.

Introduction

En los tres reinos de la vida, las especies de ARN se someten a modificaciones post-transcripcionales y la investigación sobre estas modificaciones bioquímicas funcionalmente relevantes se llama “epitranscriptomics”. La epitranscriptomics es un campo en crecimiento y se están desarrollando varios métodos para estudiar y mapear las modificaciones en moléculas de ARN (revisadas en1,2). Se han encontrado más de un centenar de modificaciones de ARN, detectadas en arneses, tRNAs, otros nRNAs, así como arneses3,4. Aunque la presencia y función de modificaciones post-transcripcionales químicamente diversas en tRNAs y ARN se estudian extensamente5,6,7,8, sólo recientemente se han caracterizado modificaciones del ARNM. En las plantas, se han identificado muchas modificaciones de ARNm hasta la fecha, incluyendo m7G en la estructura de la tapa9,m1A10,hm5C11,12,y uridilación13. Sin embargo, sólo m6A10,14,15,m5C11,16,17,y pseudouridina18 han sido mapeados en todo el transcriptoma en Arabidopsis. Las modificaciones de la base del ARNm post-transcripcional están involucradas en varios procesos de desarrollo19,20.

Uno de los enfoques más utilizados en la epitranscriptomicidad es la inmunoprecipitación de ARN metilada junto con la secuenciación profunda (MeRIP-seq). MeRIP-seq fue desarrollado en 2012 para estudiar m6A en células de mamíferos21,22. Requiere el uso de un anticuerpo para la modificación deseada y tiene como objetivo enriquecer para los fragmentos de ARN que llevan los nucleótidos modificados. Por lo general, es seguido por secuenciación profunda para identificar y mapear los fragmentos enriquecidos o PCR cuantitativo para verificar objetivos específicos de ARN. La precisión de MeRIP se basa en la especificidad del anticuerpo para reconocer el nucleótido modificado sobre modificaciones similares (por ejemplo, m5C y hm5C11,23). Además delm6A, MeRIP-seq también se ha aplicado para estudiar metilación de ARNm1A y m5C en varios organismos11,17,23,24,25.

La metilación de la citosina en la quinta posición de carbono (m5C) es la modificación de ADN más prevalente26,27 y una de las modificaciones de ARN más comunes también3,4. Mientras que m5C fue detectado en mRNAs eucariota en 197528, sólo recientemente tienen estudios centrados en mapear la modificación en todo el transcriptoma, en codificación y no codificación RNAs11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.

Los métodos alternativos utilizados en la investigación de ARN m5C incluyen la conversión química de citosinas no metiladas en uracils (secuenciación de bisulfito) y ensayos de inmunoprecipitación basados en una unión irreversible de una metiltransferasa de citosina de ARN conocida a sus objetivos de ARN (miCLIP, aza-IP). En resumen, la secuenciación de bisulfito explota la característica de la citosina metilada de 5 para ser resistente al tratamiento con bisulfito de sodio que deamina citostinas nomodificadas a uracil. El método fue desarrollado por primera vez para el ADN, pero adaptado para arn también y muchos estudios han elegido este enfoque para detectar sitios m5C en ARN16,23,29,32,34,35. Tanto miCLIP como aza-IP requieren conocimientos previos de la citosina de ARN metiltransferasa y el uso del anticuerpo respectivo. En el caso de miCLIP (metilación individual-nucleótida-resolución de enlace e inmunoprecipitación), la metiltransferasa lleva una sola mutación de aminoácidos para que se una al sustrato de ARN pero no se puede liberar30. En aza-IP (inmunoprecipitación de ARN mediada en 5 azacitadina), la unión irreversible se forma entre el nucleósido de 5 azaC y la arnesina metiltransferasa cuando la 5-azaC proporcionada exógenamente es incorporada por las polimerasas de ARN en una molécula de ARN objetivo31.

La principal ventaja de estos tres métodos es que permiten la asignación de resolución de nucleótidos únicos de m5C. Además, miCLIP y aza-IP proporcionan información sobre los objetivos específicos de una citosina de arnesa metiltransferasa seleccionada, descifrando más profundamente el mecanismo y el papel de las modificaciones post-transcripcionales del ARN. Sin embargo, el enfoque MeRIP-seq puede identificar regionesm5C de todo el transcriptoma sin ningún conocimiento previo requerido y evita condiciones químicas y de temperatura duras, como el tratamiento de bisulfitos o la incubación con 5-azaC. La secuenciación de merip y bisulfito puede ser inhibida por las estructuras secundarias de ARN36. El paso de fragmentación que se incluye en el ensayo MeRIP antes de la inmunoprecipitación tiene como objetivo facilitar la unión de anticuerpos y aumentar la resolución de la identificación m5C.

Otro método que vale la pena mencionar es la espectrometría de masas (EM) de nucleósidos de ARN. La EM puede detectar y distinguir cualquier tipo de modificación tanto en el ADN como en el ARN. Brevemente, el ARN se extrae y DNase digiere, luego se desala y digiere a nucleósidos individuales. Los nucleósidos de ARN son analizados por un espectrómetro de masas. Este método se puede utilizar para cuantificar los niveles de cada modificación y no se basa en un anticuerpo o una conversión química. Sin embargo, un inconveniente importante es que proporciona información masiva sobre la presencia de modificaciones de ARN. Para mapear las modificaciones, la EM debe combinarse con la información de digestión y secuenciación de RNase sobre moléculas específicas de ARN, como en el caso del tRNALeuhumano (CAA)37.

Aquí, describimos y discutimos el ensayo MeRIP tal como se utiliza para estudiar la metilación de ARN m5C en Arabidopsis17.

Protocol

1. Preparación del ARN Moler 200 mg de tejido vegetal a polvo en nitrógeno líquido, asegurándose de que el tejido permanezca congelado durante todo el procedimiento. Extraiga el ARN del tejido vegetal deseado siguiendo un protocolo de extracción de tiocyanato de guanidinio ácido-fenol-cloroformo. Para disminuir la posibilidad de contaminar el ARN con ADN durante la separación por fases, utilice 1-bromo-3-cloropropano en lugar de cloroformo. Añadir 1 ml de reactivo de extracción de ARN que contiene tiocyanato de guanidina y fenol ácido al tejido vegetal moliado (500 μL por 100 mg de tejido). Mezcle bien invirtiendo y asegúrese de que todo el tejido esté mojado. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente para disociar los complejos ribonucleoprotein. Centrífuga durante 10 minutos a 12.000 x g a 4 °C y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml. Añadir 200 μL de 1-bromo-3-cloropropano (100 μL por 500 μL reactivo de extracción de ARN) y vórtice vigorosamente. Centrífuga durante 15 min a 12.000 x g a 4 °C y transferir la fase acuosa superior (aprox. 500 μL) a un nuevo tubo de 1,5 ml. Añadir 1 volumen de isopropanol (500 μL) y 0,1 volumen de acetato de sodio de 3 M pH 5,5 (50 μL), mezclar bien invirtiendo y precipitar 10 min a -20 °C.NOTA: Se recomienda el uso de acetato de sodio (NaOAc) con el fin de mejorar la precipitación de ARN. El protocolo se puede pausar en este punto prolongando la precipitación de ARN durante unas horas o incluso durante la noche. Centrífuga durante 30 min a 12.000 x g a 4 °C y deseche el sobrenadante. Lave el pellet dos veces con 500 μL del 80% de EtOH, centrífuga durante 5 min a 12.000 x g a 4 °C y deseche. Lave el pellet una vez con 500 μL 99% EtOH, centrífuga durante 5 min a 12.000 x g a 4 °C y deseche. Seque el pellet durante 5-10 min y disuelva en 30 μL de H2O sin RNase.NOTA: En su lugar, utilice cualquier protocolo de extracción de ARN de elección (por ejemplo, un sistema basado en columnas). Si se incluye una digestión DNase en el protocolo, omitala en el paso siguiente (paso 1.3). Mida la concentración de ARN (por ejemplo, con el uso de un espectrofotómetro) y digiera 20 μg de ARN con DNase.NOTA: El ADN es rico en m5C y el anticuerpo no distingue entre ADN y ARN. En una reacción típica de DNase, trate 10 μg de ARN en una reacción de 50 μL. Mezcle los siguientes componentes e incuba las reacciones a 37 °C durante 30 min:10 μg de ARN x μL10x Tampón DNase 5 μLDNase 1 μL (2 unidades)RNase-free H2O hasta 50 μL Retire la enzima añadiendo un volumen adecuado de reactivo de inactivación DNase (si está incluido en el kit DNase y de acuerdo con las instrucciones del fabricante) o realizando un paso de limpieza (por ejemplo, purificación de columnas o extracción de fenol/cloroformo). Compruebe la calidad y pureza del ARN aislado mediante electroforesis capilar y proceda si el número de integridad del ARN (RIN) es superior a 7, para asegurarse de que las muestras son de buena calidad. OPCIONAL: Retire el ARN ribosomal para enriquecer las muestras en contenido de ARNm utilizando un kit de eliminación de ARN y de acuerdo con el protocolo del fabricante. Utilice el ARN tratado DNase del paso anterior para las reacciones de agotamiento del ARN. Realice reacciones múltiples si la cantidad de ARN total es mayor que la cantidad máxima sugerida para la reacción. Tenga en cuenta que sólo el 5-10% de la cantidad de entrada se recuperará después del agotamiento del ARN. Proceda con el ARN agotado rRNA (cantidad igual para todas las muestras) e ignore las cantidades mencionadas en los pasos siguientes, ya que se refieren al ARN total.NOTA: Para una comparación y descripción de los métodos de agotamiento de rRNA disponibles, consulte las referencias 38,39,40. rRNA es la mayor parte del ARN total y es m5C metilado en muchos organismos. Preparar previamente transcripciones in vitro (IVT) para ser utilizadas como secuencias de ARN de control y agregarlas en las muestras. Producir dos ICT distintos utilizando un kit de transcripción in vitro, uno con nucleósidos no metilados y otro donde rCTP es reemplazado por 5-metil-rCTP, para servir como controles negativos y positivos en MeRIP, respectivamente. Las transcripciones preparadas fueron las de EGFP y Renilla luciferase.NOTA: Los IVT no deben existir en el transcriptoma del organismo que está analizando. Si los IVT son de la misma plantilla (por ejemplo, ambos EGFP), agregue el control positivo y negativo en dos muestras diferentes. Si su secuencia es diferente (por ejemplo, EGFP y Renilla), se pueden agregar a la misma muestra. Pico en cada muestra 0,1 ng IVT por 3 μg de ARN, como controles. Sonicar el ARN a aproximadamente 100 nt fragmentos.NOTA: Las condiciones para la cizallamiento de ARN deben ajustarse de antemano y difieren para cada sonicator. Para el modelo utilizado aquí, la sonicación se realiza con las siguientes condiciones: Potencia máxima 174, Factor de servicio 10, Ciclos/ráfaga 200, 17 min. Sonicate la misma cantidad de ARN para todas las muestras, al menos 12 μg de ARN por muestra en 80 μL de volumen total (mín. 60 μL, máx. 100 μL), lleno de RNase-free H2O. Confirme la eficiencia de la sonicación y la concentración de las muestras de ARN por electroforesis capilar. El tamaño promedio del ARN fragmentado debe ser de alrededor de 100 nt. 2. Inmunoprecipitación de ARN metilado (MeRIP) En los tubos de baja unión, añadir 9 μg de ARN sonicado y RNase-free H2O hasta 60 μL (o más, dependiendo de la concentración). Disociar las estructuras secundarias calentando el ARN a 70 °C en un baño de agua durante 10 minutos y enfriándose durante 10 minutos adicionales en una mezcla de agua helada. Divida la muestra en tres partes: un tercio (20 μL, si se tomaron 60 μL en el paso 2.1) se guarda en un tubo separado a -80 °C como muestra de entrada. Llene los 40 μL restantes con RNase-free H2O hasta 860 μL y luego divida en dos tubos de baja unión: uno para IP y otro para el control Mock (430 μL cada uno). Añadir a ambos tubos:50 μL de tampón MeRIP de 10×10 μL de inhibidor de la RNase10 μL de anticuerpo α-m5C (10 μg) en la muestra IP por 10 μL de H2O en la muestra SimuladaNOTA: El clon de anticuerpos utilizado anteriormente ya no está disponible comercialmente. Sin embargo, cualquier anticuerpo monoclonal anti-5-metilcitosina debe funcionar de manera similar. Los anticuerpos deben hacerse la prueba de especificidad antes de utilizarse para MeRIP11,23. Sella los tubos con parafilm e incuba durante 12-14 horas a 4 °C, con rotación aérea. Al día siguiente, prepare las cuentas magnéticas G proteicas para la unión. Para cada tubo (ip o control simulado), utilice 40 μL de cuentas. Añadir la cantidad total de cuentas (# de tubos x 40 μL, por ejemplo, para 2 muestras IP y 2 Mock, se necesitan 160 μL de cuentas) en un tubo de 15 ml y lavar tres veces con 800 μL de búfer MeRIP 1x por muestra (# de tubos x 800 μL buffer, por ejemplo, 3.2 mL para 2 muestras IP y 2 Mock). Realice lavados a temperatura ambiente durante 5 minutos con rotación aérea, recoja las cuentas con la ayuda de un bastidor magnético y deseche el búfer de lavado. Después del tercer lavado, resuspend las cuentas en el mismo volumen de 1x buffer MeRIP que el volumen inicial de cuentas tomadas (# de tubos x 40 μL, por ejemplo, 160 μL de 1x búfer MeRIP para 2 muestras IP y 2 Mock).NOTA: La cantidad de cuentas G proteicas utilizadas está determinada por la capacidad de unión de las cuentas para el tipo de anticuerpo específico y la cantidad de anticuerpos utilizados. En este caso, las cuentas tienen una capacidad de unión de aprox. 8 μg de ratón IgG por mg de cuentas y 30 mg/mL de concentración. Por lo tanto, 40 μL son suficientes para unir aprox. 9,6 μg de anticuerpo. Añadir 40 μL de cuentas resuspendidas a cada muestra IP y Mock e incubar durante 2 horas adicionales a 4 °C, con rotación de sobrecarga. Coloque los tubos en un bastidor magnético durante 1 minuto y deseche el sobrenadante o guárdelo como control (muestra de ARN no enlazada). Lave las cuentas 5 veces resuspending en 700 μL de 1x buffer MeRIP suministrado con 0.01% Tween 20 e incubando durante 10 minutos a temperatura ambiente con rotación aérea. Resuspend las cuentas lavadas en 200 μL de tampón de digestión Proteinase K y añadir 3,5 μL de Proteinase K. Incubar durante 3 horas a 50 °C, temblando a 800 rpm. Ocasionalmente, deslice manualmente la parte inferior del tubo si se está formando un sedimento de cuentas durante la incubación. Extraiga el ARN mediante la adición de 800 μL de reactivo de extracción de ARN y siguiendo un protocolo de extracción de tiocyanato de guanidinio ácido-fenol-cloroformo, y continúe como en el paso 1.2. Para aumentar la visibilidad del pellet de ARN, se puede añadir un co-precipitante de color en isopropanol en el paso de precipitación. Resuspend el pellet en 20 μL de RNase-free H2O (o igual al volumen de entrada mantenido en el paso 2.3). 3. Análisis descendente Envíe las muestras de entrada e IP para la secuenciación de un solo extremo con 50 bases de longitud de lectura (SE50). Recorta 3′ los adaptadores finales usando cutadapt41 y descarta lecturas que son más cortas que 48 nt. Mapa recortado lee al genoma arabidopsis (anotación TAIR10) utilizando STAR42 con un límite del 6% para desajustes y tamaño máximo de intron de 10 kb. Mantenga las lecturas asignadas de forma única para su posterior análisis. Identifique fragmentos de ARN enriquecidos en muestras IP en comparación con Input utilizando dos métodos distintos y considere los que ambos encuentran significativamente enriquecidos. Primero, detecte los picos MeRIP-seq usando el llamador máximo MACS243 en las direcciones IP agrupadas versus la entrada. En segundo lugar, siga el análisis de las llamadas de pico MeRIP-seq como se describe en Meyer et al.22 y Yang et al.17. Usando scripts R personalizados, divida el genoma en ventanas distintas de 25 nt y cuente el número de lecturas asignadas de forma única para cada ventana en función de la posición del último nucleótido asignado (ya que las lecturas se originan a partir de fragmentos de ARN de 100 nt). Calcule ventanas significativamente enriquecidas en muestras IP en comparación con Entrada con la prueba exacta de Fisher. Mantenga los picos significativamente enriquecidos que se extienden por al menos dos ventanas consecutivas y deseche picos que cubran solo una ventana. Identifique las regiones anotadas del genoma (transcripciones) con picos significativamente enriquecidos encontrados por ambos métodos. Alternativamente o de forma complementaria, pruebe objetivos específicos de ARN para su enriquecimiento en las muestras ip. Transcriba inverso el ARN (mismo volumen de muestras de entrada, IP y simulación) con hexameros aleatorios. Realice PCR cuantitativo en tiempo real en los objetivos elegidos, comparando entrada, IP y simulación a través del método ΔΔCt.NOTA: El producto generado no debe ser superior a 100 bp, ya que este es el tamaño medio de fragmentación.

Representative Results

Se proporciona un esquema del método en la figura 1. Los primeros pasos críticos del protocolo son obtener ARN de buena calidad (RIN ≥ 7) y sonicarlo a aproximadamente fragmentos de 100 nt. La eficiencia de ambos pasos es examinada por una máquina de electroforesis capilar a base de virutas. En la Figura 2A, se muestra una ejecución representativa de una buena muestra de ARN. La muestra se diluye 1:10 antes de cargar en el chip con el fin de tener una concentración que está en el rango de detección del kit utilizado (5-500 ng / μL). El mismo ejemplo también se ejecuta después de la sonicación y se muestra en la figura 2B. Observe la presencia de un pico uniforme desplazado a la izquierda del diagrama, a un tamaño de alrededor de 100 nucleótidos. La menor concentración se debe tanto a la pérdida de ARN durante la fragmentación como al aumento del volumen de las muestras (60-100 μL, paso 1.7.1). La calidad de las muestras IP y Mock se puede evaluar mediante qRT-PCR. Con este fin, los IVT con picos sirven como controles positivos y negativos: se espera que la IVT metilada, donde en todas las posiciones de citosina hay m5C, se enriquezca en gran medida en la muestra ip; por el contrario, la IVT no metilada no debería tener una diferencia entre IP y Mock. Las imprimaciones utilizadas en el ensayo qRT-PCR para los dos IVT de control(EGFP y Renilla luciferase) se enumeran en el cuadro 1. De hecho, como se muestra en la Figura 3, alrededor del 80% del IVT metilado se recuperó en la muestra IP, y sólo aproximadamente el 2% en el Simulado. Para el control no metilado, la recuperación fue inferior al 1% tanto en muestras IP como simuladas. Esto verifica la eficiencia de MeRIP que los fragmentos de ARN metilados fueron precipitados y enriquecidos, y es un buen indicador de que las muestras se pueden utilizar para el análisis posterior. Además, el enriquecimiento plegable de la IVT no metilada (relación IP-Simulado) puede aplicarse como umbral para estimar la importancia del enriquecimiento en los ensayos qRT-PCR. Después de alinear las lecturas con el genoma (Figura 4), los algoritmos de llamada máxima descritos en los pasos 3.4.1 y 3.4.2 se aplican para identificar las ventanas estadísticamente significativas, enriquecidas en las muestras IP en comparación con la entrada. Las secuencias que corresponden a estas ventanas se pueden utilizar más, por ejemplo, para buscar motivos relacionados con la metilación conservados11,17. Figura 1: Representación esquemática del protocolo MeRIP-seq.Las muestras de ARN se incuban con un anticuerpo para citosinas metiladas con 5 y los complejos se extraen con cuentas magnéticas G proteicas que capturan los anticuerpos junto con el ARN unido. Las muestras de ARN eluted son analizadas por secuenciación profunda y qRT-PCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Resultados representativos del análisis de calidad de muestras de ARN.(A) Perfil representativo de una muestra total cualificada de la planta de ARN. (B) Perfil representativo de una muestra de ARN después de la sonicación a fragmentos de 100 nt. Archivos de salida del software de electroforesis capilar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: análisis qRT-PCR de los IVT de control.Las transcripciones in vitro metiladas y no metiladas se utilizaron como controles positivos y negativos del ensayo MeRIP, respectivamente. Después de la inmunoprecipitación, el IVT metilado está altamente enriquecido en la muestra IP (verde) pero no en la muestra Simulada (sin anticuerpo anti-m5C; púrpura). El IVT no metilado no mostró ningún enriquecimiento ni diferencia entre IP y Mock. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Lea la alineación antes y después de MeRIP alrededor de una transcripción representativa.Lee alineado con una transcripción específica en el ejemplo entrada (fila superior) y en dos réplicas IP (fila central e inferior). La caja negra muestra una ventana enriquecida identificada de 50 nt de largo basada en macs243 y meRIP-seq22 análisis de alta llamada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Objetivo Primer par Secuencia de productos Longitud del producto EGFP Para: 5′- GGCAACTACAAGACCCGCGCC -3′ GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC 72 bp Rev: 5′- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3′ Renilla luciferasa Para: 5′- GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAAC -3′ GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACCATGTTGCCATCAAAAATCATGAGAAAGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC 75 bp Rev: 5′- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAA -3′ Tabla 1: Información sobre las imprimaciones y los productos generados para el análisis qRT-PCR. Recetas de búfer. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

El ARN lleva más de cien modificaciones de base distintas4 que forman el epitranscriptome44. Estas modificaciones añaden una capa adicional de regulación de la traducción y la señalización (revisada en5,6,8,20,45,46). Los primeros estudios fueron capaces de detectar la presencia de modificaciones post-transcripcionales en ARN28,47, pero los ARN modificados específicos necesitan ser identificados con el fin de entender el papel de la epitranscriptomica. MeRIP fue diseñado como un método para mapear sitios de metilación de ARN de todo el mundo21,22. Se puede adaptar a cualquier modificación, si hay un anticuerpo específico disponible.

La principal fortaleza de este protocolo es que es relativamente simple, seguro para el ARN y el usuario (por ejemplo, 5-azaC es altamente tóxico para las plantas y los seres humanos) y no requiere información de secuencia o modificación de enzimas. Además, el enriquecimiento de ARN metilados por la P.I. aumenta las posibilidades de que se detecten mRNAs de baja abundancia, a diferencia de la secuenciación de bisulfitos que no contiene un paso de enriquecimiento. Cuando se realizan dos rondas serie de MeRIP, el enriquecimiento en fragmentos de ARN que contienen sitios de metilación aumenta aún más22. Una de las limitaciones de MeRIP, especialmente cuando se aplica a estudios de metilación de ARNm, es la alta cantidad de ARN requerida como entrada para el ensayo. El paso de ribodepleción – o poli(A) – reducirá el fondo causado por el ARN ribosomal fuertemente modificado, pero elimina más del 90% del ARN total. El ADN también debe eliminarse por completo, ya que es rico en citosinas metiladas de 5. Otro inconveniente es la menor resolución de la posición exacta de la metilación. La sonicación del ARN antes de la incubación con el anticuerpo ayuda a esta dirección al reducir la región que contiene la modificación a 100-200 nucleótidos. Cuando MeRIP se combina con secuenciación profunda, la resolución de la predicción del sitio m5C aumenta a medida que la secuenciación lee formar una distribución gaussiana alrededor del sitio potencial de metilación. Además, la especificidad del anticuerpo debe confirmarse antes del ensayo (por ejemplo, con ensayos de manchas de puntos de ARN, realizados con oligos sintetizados con nucleótidos modificados), sin embargo, hasta qué punto un anticuerpo puede distinguir realmente entre modificaciones estrechamente relacionadas (por ejemplo, m6A y m6Am) es un punto de discusión en el campo48,49. Además, los ARN altamente estructurados podrían interferir con la interacción anticuerpo-antígeno, otra restricción que se aborda principalmente con la fragmentación y desnaturalización del ARN antes de la P.I. Por el contrario, la secuenciación de bisulfitos que también se ve afectada por estructuras secundarias, no incluye un paso de fragmentación y esta podría ser una razón que causa discrepancia entre los sitiosm5C y los mRNAs predichos por la secuenciación de bisulfitos16 y MeRIP-seq11,17. Otras modificaciones de la citosina (por ejemplo, hm5C) también son resistentes a la deaminación mediada por bisulfito35.

Las modificaciones de MeRIP-seq incluyen un paso de enlace cruzado, ya sea con la introducción de un ribonucleoside fotoactivatable (foto-crosslinking-assisted m6A-seq, PA-m6A-seq 50)o utilizando luz UV para crear enlaces cruzados anticuerpo-ARN después de la IP (miCLIP49,método diferente al miCLIP descrito en la introducción30,pero también con resolución de nucleótidos individuales). En el futuro, y a medida que se acumule conocimiento sobre la metilación del ARN, podrían ser preferibles enfoques más específicos, basados en las enzimas modificadoras y/o en las secuencias de consenso donde aparece la metilación. La identificación de las proteínas lectoras es esencial para la comprensión de la función molecular y de señalización de las modificaciones post-transcripcionales. La tecnología de secuenciación nanopore ya permite la identificación directa de nucleótidos modificados sin tratamiento previo del ARN17, pero todavía hay margen de mejora en este campo con respecto a la profundidad de secuencia y el análisis bioinformática. En general, MeRIP-seq es actualmente un enfoque establecido, confiable e imparcial para identificar transcripciones de ARN metiladas.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por un estipendio de doctorado del IMPRS a E.S, una beca a largo plazo de EMBO a V.P., y fondos internos MPI-MPP a F.K. Parte de este trabajo también se financió a través de PLAMORF, un proyecto que ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (Acuerdo de Subvenciones Nº 810131). Los autores quieren agradecer a Federico Apelt el análisis bioinformática y los comentarios sobre el manuscrito, y a Mathieu Bahin y Amira Kramdi por el análisis bioinformática.

Materials

α‐m5C antibody ZymoResearch A3001 (discontinued), A3002 available Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available
Chip and reagents for capillary electrophoresis Agilent 5067-1511 RNA 6000 Nano kit
Dnase Ambion AM1907 TURBO DNA-free kit
Co-precipitant of nucleic acids Ambion AM9515 Glycoblue, 15 mg/mL
In vitro transcription kit Promega P1300 T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System
Low-binding reaction tubes Kisker Biotech G017 1.7 ml microcentrifuge tubes
Protein G magnetic beads Invitrogen 10003D Dynabeads Protein G
Proteinase K Ambion AM2546 20mg/mL stock solution, RNA grade
RNase inhibitor Promega N2615 RNasin Plus 40 U/μl
rRNA removal kit Epicentre RZPL11016 Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)
Sonication tubes Covaris 520045 microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm
RNA extraction reagent Ambion 15596018 TRIzol reagent
Equipment
Capillary electrophoresis machine Agilent G2939BA 2100 Bioanalyzer System
Magnetic rack Invitrogen 12321D DynaMag-2
Microentrifuge Eppendorf discontinued 5417R model
Rotator Benchmark R4040 RotoBot Mini
Sonicator Covaris 500217 S220 Focused-ultrasonicator
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONEC-W NanoDrop OneC
Waterbath GFL 1012 1012 Incubation bath
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References

  1. Trixl, L., Lusser, A. The dynamic RNA modification 5-methylcytosine and its emerging role as an epitranscriptomic mark. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), 1-17 (2019).
  2. Mongan, N. P., Emes, R. D., Archer, N. Detection and analysis of RNA methylation. F1000Research. 8, 559 (2019).
  3. Cantara, W. A., et al. The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update. Nucleic Acids Research. 39, 195-201 (2011).
  4. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (1), 303-307 (2018).
  5. Agris, P. F. Bringing order to translation: the contributions of transfer RNA anticodon-domain modifications. EMBO reports. 9 (7), 629-635 (2008).
  6. Chow, C. S., Lamichhane, T. N., Mahto, S. K. Expanding the Nucleotide Repertoire of the Ribosome with Post-Transcriptional Modifications. ACS Chemical Biology. 2 (9), 610-619 (2007).
  7. Gigova, A., Duggimpudi, S., Pollex, T., Schaefer, M., Koš, M. A cluster of methylations in the domain IV of 25S rRNA is required for ribosome stability. RNA. 20 (10), 1632-1644 (2014).
  8. Motorin, Y., Helm, M. tRNA Stabilization by Modified Nucleotides. Biochemistry. 49 (24), 4934-4944 (2010).
  9. Shatkin, A. Capping of eucaryotic mRNAs. Cell. 9 (4), 645-653 (1976).
  10. Shen, L., et al. N 6 -Methyladenosine RNA Modification Regulates Shoot Stem Cell Fate in Arabidopsis. Developmental Cell. 38 (2), 186-200 (2016).
  11. Cui, X., et al. 5-Methylcytosine RNA Methylation in Arabidopsis Thaliana. Molecular Plant. 10 (11), 1387-1399 (2017).
  12. Huber, S. M., et al. Formation and abundance of 5-hydroxymethylcytosine in RNA. ChemBioChem. 16 (5), 752-755 (2015).
  13. Zuber, H., et al. Uridylation and PABP Cooperate to Repair mRNA Deadenylated Ends in Arabidopsis. Cell Reports. 14 (11), 2707-2717 (2016).
  14. Luo, G. Z., et al. Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana. Nature Communications. 5 (1), 5630 (2014).
  15. Wan, Y., et al. Transcriptome-wide high-throughput deep m6A-seq reveals unique differential m6A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana. Genome Biology. 16 (1), 1-26 (2015).
  16. David, R., et al. Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs. The Plant Cell. 29 (3), 445-460 (2017).
  17. Yang, L., et al. m5C Methylation Guides Systemic Transport of Messenger RNA over Graft Junctions in Plants. Current Biology. 29 (15), 2465-2476 (2019).
  18. Sun, L., et al. Transcriptome-wide analysis of pseudouridylation of mRNA and non-coding RNAs in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 70 (19), 5089 (2019).
  19. Chmielowska-Bąk, J., Arasimowicz-Jelonek, M., Deckert, J. In search of the mRNA modification landscape in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 421 (2019).
  20. Liang, Z., Riaz, A., Chachar, S., Ding, Y., Du, H., Gu, X. Epigenetic Modifications of mRNA and DNA in Plants. Molecular Plant. 13 (1), 14-30 (2020).
  21. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  22. Meyer, K. D., et al. Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3′ UTRs and near Stop Codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  23. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m5C within archaeal mRNAs. PLoS genetics. 9 (6), 1003602 (2013).
  24. Dominissini, D., et al. The dynamic N1-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
  25. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N1-methyladenosine methylome. Nature Chemical Biology. 12 (5), 311-316 (2016).
  26. Hotchkiss, R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. Journal of Biological Chemistry. 175 (175), 315-332 (1948).
  27. Wyatt, G. R. Occurence of 5-Methyl-Cytosine in Nucleic Acids. Nature. 166, 237-238 (1950).
  28. Dubin, D. T., Taylor, R. H. The methylation state of poly A-containing- messenger RNA from cultured hamster cells. Nucleic Acids Research. 2 (10), 1653-1668 (1975).
  29. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1-16 (2017).
  30. Hussain, S., et al. NSun2-mediated cytosine-5 methylation of vault noncoding RNA determines its processing into regulatory small RNAs. Cell Reports. 4 (2), 255-261 (2013).
  31. Khoddami, V., Cairns, B. R. Identification of direct targets and modified bases of RNA cytosine methyltransferases. Nature biotechnology. 31 (5), 458-464 (2013).
  32. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  33. Yang, X., et al. 5-methylcytosine promotes mRNA export – NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27 (5), 606-625 (2017).
  34. Burgess, A., David, R., Searle, I. R. Conservation of tRNA and rRNA 5-methylcytosine in the kingdom Plantae. BMC Plant Biology. 15 (1), 199 (2015).
  35. Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing. Nucleic Acids Research. 37 (2), (2009).
  36. Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nature Genetics. 37 (8), 853-862 (2005).
  37. Auxilien, S., Guérineau, V., Szweykowska-Kulińska, Z., Golinelli-Pimpaneau, B. The human tRNA m (5) C methyltransferase Misu is multisite-specific. RNA Biology. 9 (5), 1331-1338 (2012).
  38. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
  39. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterial biofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7 (1), 41114 (2017).
  40. Huang, Y., Sheth, R. U., Kaufman, A., Wang, H. H. Scalable and cost-effective ribonuclease-based rRNA depletion for transcriptomics. Nucleic Acids Research. 48 (4), 20 (2020).
  41. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  42. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  43. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), 137 (2008).
  44. Saletore, Y., et al. The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications. Genome Biology. 13 (10), 175 (2012).
  45. Schwartz, S. Cracking the epitranscriptome. RNA. 22 (2), 169-174 (2016).
  46. Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2016).
  47. Keith, G. Mobilities of modified ribonucleotides on two-dimensional cellulose thin-layer chromatography. Biochimie. 77 (1-2), 142-144 (1995).
  48. Feederle, R., Schepers, A. Antibodies specific for nucleic acid modifications. RNA Biology. 14 (9), 1089-1098 (2017).
  49. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  50. Chen, K., et al. High-Resolution N 6 -Methyladenosine (m 6 A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m 6 A Sequencing. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).

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Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (159), e61231, doi:10.3791/61231 (2020).
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