JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

ميثيل الحمض النووي الريبي الفحص المناعي لدراسة m5C التعديل في arabidopsis

Published: May 14, 2020
doi:
10.3791/61231
, , ,
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, 2Department of Molecular Medicine, Medical School,University of Padua, 3Biologie de l’Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France

Summary

ميثيل الحمض النووي الريبي ميثيل المناعة المقايسة هو طريقة تعتمد على الأجسام المضادة المستخدمة لإثراء لشظايا الحمض النووي الريبي الميثيل. إلى جانب التسلسل العميق ، فإنه يؤدي إلى تحديد النصوص التي تحمل تعديل M5C.

Abstract

تعديلات القاعدة الثانوية على RNA، مثل M5C، تؤثر على هيكل ووظيفة جزيئات الحمض النووي الريبي المعدلة. ميثيل الحمض النووي الريبي المناعي والتسلسل (MeRIP-seq) هو الطريقة التي تهدف إلى إثراء الحمض النووي الريبي الميثيلي وتحديد في نهاية المطاف النصوص المعدلة. لفترة وجيزة، هو احتضنته سونيكاتيد RNA مع جسم مضاد لل 5-ميثيثيات السيتوسين وعجلت بمساعدة من الخرز البروتين G. ثم يتم تسلسل الشظايا المخصبة ويتم تعيين مواقع المثيل المحتملة استنادًا إلى توزيع القراءات والكشف عن الذروة. يمكن تطبيق MeRIP على أي كائن حي ، لأنه لا يتطلب أي تسلسل سابق أو تعديل المعرفة الانزيم. بالإضافة إلى ذلك ، إلى جانب التشظي ، لا يتعرض الجيش الملكي النيبالي لأي علاج كيميائي أو درجة حرارة أخرى. ومع ذلك، فإن MeRIP-seq لا توفر تنبؤا أحادي النيوكليوتيدات لموقع المثيلات كما تفعل الطرق الأخرى، على الرغم من أن المنطقة الميثيلية يمكن تضييقها إلى عدد قليل من النيوكليوتيدات. استخدام مختلف تعديل محددة الأجسام المضادة يسمح MeRIP ليتم تعديلها لمختلف التعديلات الأساسية الموجودة على RNA، وتوسيع التطبيقات المحتملة لهذا الأسلوب.

Introduction

في جميع الممالك الثلاث من الحياة، تخضع أنواع الحمض النووي الريبي (RNA) لتعديلات ما بعد النسخ، وتسمى الأبحاث حول هذه التعديلات الكيميائية الحيوية ذات الصلة وظيفياً “epitranscriptomics”. Epitranscriptomics هو حقل متزايد ويجري تطوير أساليب مختلفة لدراسة خريطة التعديلات على جزيئات الحمض النووي الريبي (استعرضت في1،2). تم العثور على أكثر من مائة التعديلات الجيش الملكي النيبالي، الكشف عن في rRNAs، tRNAs، ncRNAs الأخرى، فضلا عن mRNAs3،4. على الرغم من وجود وظيفة من التعديلات المتنوعة كيميائيا بعد النسخ في tRNAs وrRNAs تدرس على نطاق واسع5,6,7,8, فقط مؤخرا وقد تم وصف تعديلات مرنا. في النباتات، وقد تم تحديد العديد من التعديلات مرنا حتى الآن، بما في ذلك7G في هيكل الغطاء9، م1A10، hm5C11،12، و uridylation13. ومع ذلك، فقط م6A10،14،15،م5C11،16،17،و pseudouridine18 وقد تم تعيين transcriptome واسعة في arabidopsis. بعد النسخ التعديلات قاعدة مرنا تشارك في العديد من العمليات التنموية19,20.

واحدة من النهج الأكثر شيوعا في epitranscriptomics هو ميثيل الحمض النووي الريبي المناعي إلى جانب تسلسل عميق (MeRIP-seq). تم تطوير MeRIP-seq في عام 2012 لدراسة m6A في خلايا الثدييات21,22. وهو يتطلب استخدام جسم مضاد للتعديل المطلوب ويهدف إلى إثراء شظايا الحمض النووي الريبي التي تحمل النيوكليوتيدات المعدلة. وعادة ما يتبع ذلك تسلسل عميق لتحديد وتعيين الشظايا المخصبة أو PCR الكمية للتحقق من أهداف محددة للرنا. ويستند دقة MeRIP على خصوصية الأجسام المضادة للتعرف على النيوكليوتيد المعدلة على تعديلات مماثلة (على سبيل المثال، م5C وhm5C11،23). بالإضافة إلى م6A، MeRIP-seq كما تم تطبيق لدراسة م1A و M5C RNA methylation في عدة كائنات11،17،23،24،25.

Methylation من السيتوسين في موقف الكربون الخامس (م5C) هو التعديل الحمض النووي الأكثر انتشارا26,27 واحدة من التعديلات RNA الأكثر شيوعا جدا3,4. في حين تم الكشف عن م5C في mRNAs eukaryotic في 197528, مؤخرا فقط دراسات ركزت على رسم خرائط التعديل transcriptome واسعة, في الترميز وغير الترميز RNAs11,16,17,23,29,30,31,33,34.

وتشمل الطرق البديلة المستخدمة في بحوثالحمضالنووي الريبي 5 C التحويل الكيميائي للسيتوسينات غير الميثيلية إلى uracils (تسلسل ثنائي الفقار) وفرزات المناعة القائمة على ربط لا رجعة فيه من RNA cytosine ميثيلtransferase المعروفة لأهدافها الحمض النووي الريبي (miCLIP، aza-IP). وباختصار، فإن تسلسل البيسولفيت يستغل ميزة السيتوسين 5-ميثيل لتكون مقاومة لعلاج بيسلفيت الصوديوم الذي deaminates السيتوسين غير المعدلة إلى uracil. وقد وضعت الطريقة الأولى للحمض النووي ولكن تكييفها للRNA جدا والعديد من الدراسات وقد اختارت هذا النهج للكشف عن مواقع5C في RNA16،23،29،32،34،35. كل من miCLIP و aza-IP تتطلب معرفة سابقة من RNA cytosine ميثيلtransferase واستخدام الأجسام المضادة المعنية. في حالة miCLIP (المثيلة الفردية-النيوكليوتيد القرار crosslinking والمناعة), يحمل ميثيلtransferase طفرة واحدة من الأحماض الأمينية بحيث أنه يرتبط الركيزة RNA ولكن لا يمكن أن يطلق30. في aza-IP (5-azacytidine-RNA-توسط RNA المناعة)، يتم تشكيل الربط لا رجعة فيه بين 5-azaC nucleoside وRNA cytosine ميثيلtransferase عندما يتم تضمينها بشكل خارجي 5-azaC بواسطة البوليمرات RNA في جزيء RNA الهدف31.

والميزة الرئيسية لهذه الأساليب الثلاث هي أنها تسمح برسم خرائط دقة النيوكليوتيد الأحادية m5C. بالإضافة إلى ذلك، miCLIP وaza-IP تقديم معلومات حول أهداف محددة من RNA cytosine ميثيلtransferase، فك أعمق آلية ودور تعديلات الحمض النووي الريبي بعد النسخ. ومع ذلك، فإن نهج MeRIP-seq يمكن تحديد مناطق5C على نطاق النص دون أي معرفة سابقة مطلوبة وتجنب الظروف الكيميائية ودرجة الحرارة القاسية، مثل علاج ثنائي الفقار أو الحضانة مع 5-azaC. كل من MeRIP و بيسولفيت التسلسل يمكن أن تكون مثبطة من قبل الهياكل RNAالثانوية 36. تهدف خطوة التشظية التي يتم تضمينها في فحص MeRIP قبل الاعتياد إلى تسهيل ربط الأجسام المضادة وزيادة دقة تحديد m5C.

طريقة أخرى جديرة بالذكر هي قياس الطيف الكتلي (MS) من نيوكليوسيدات الحمض النووي الريبي. يمكن للتصلّد المتعدد اكتشاف وتمييز أي نوع من التعديل على الحمض النووي والحمض النووي الريبي .على حد سواء. لفترة وجيزة، يتم استخراج رنا وDNase هضم، ثم تحللت وهضمها إلى النيوكليوسيدات واحدة. يتم تحليل النيوكليوسيدات الـ RNA بواسطة مطياف الكتلة. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد مستويات كل تعديل ولا تعتمد على جسم مضاد أو تحويل كيميائي. ومع ذلك، عيب رئيسي هو أنه يوفر معلومات مجمعة حول وجود تعديلات RNA. من أجل رسم خريطة التعديلات، يجب أن يتم دمج التصلب المتعدد مع هضم RNase ومعلومات التسلسل حول جزيئات الحمض النووي الريبي المحددة، كما هو الحال في الـ tRNALeu(CAA)37.

هنا، ونحن وصف ومناقشة مقايسة MeRIP كما تستخدم لدراسة م5C RNA الميثيل في Arabidopsis17.

Protocol

1. إعداد الجيش الملكي النيبالي طحن 200 ملغ من الأنسجة النباتية إلى مسحوق في النيتروجين السائل، والتأكد من أن الأنسجة لا تزال مجمدة طوال العملية. استخراج RNA من الأنسجة النباتية المطلوبة بعد حمض guanidinium thiocyanate-الفينول-الكلوروفورم استخراج البروتوكول. لتقليل إمكانية تلويث الحمض النووي الريبي بالحمض النووي (DNA) أثناء فصل المرحلة، استخدم 1-برومو-3-كلوروبروبان بدلاً من الكلوروفورم. إضافة 1 مل من مُكْشف استخراج الحمض النووي الريبي (RNA) الذي يحتوي على ثيوسيانات الجوانيدين والفينول الحمضي إلى الأنسجة النباتية المطحونة (500 ميكرولتر لكل 100 ملغ). تخلط جيدا عن طريق عكس وتأكد من جميع الأنسجة الرطب. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتفكك مجمعات ريبونوكليوبروتين. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقيقة في 12000 س ز في 4 درجة مئوية ونقل فائقة إلى أنبوب جديد 1.5 مل. إضافة 200 ميكرولتر من 1-برومو-3-الكلوروبروبان (100 ميكرولتر لكل 500 ميكرولتر RNA استخراج كاشف) ودوامة بقوة. جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة في 12000 س ز في 4 درجة مئوية ونقل المرحلة العليا مائي (حوالي 500 ميكرولتر) إلى أنبوب جديد 1.5 مل. إضافة 1 حجم من الايزوبروبانول (500 ميكرولتر) و 0.1 حجم 3 M خلات الصوديوم 5.5 (50 ميكرولتر)، اخلط جيدا عن طريق عكس وتترسب 10 دقيقة في -20 درجة مئوية.ملاحظة: يوصى باستخدام خلات الصوديوم (NaOAc) من أجل تعزيز هطول الأمطار من الحمض النووي الريبي. ويمكن إيقاف البروتوكول عند هذه النقطة عن طريق إطالة هطول الأمطار من الجيش الملكي النيبالي لبضع ساعات أو حتى بين عشية وضحاها. جهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة في 12،000 س ز في 4 درجة مئوية والتخلص من الفائق. غسل بيليه مرتين مع 500 μL من 80٪ EtOH، والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 12،000 س ز في 4 درجة مئوية والتخلص منها. غسل بيليه مرة واحدة مع 500 μL 99٪ EtOH، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 12،000 × ز في 4 درجة مئوية والتخلص منها. جفف بيليه لمدة 5-10 دقيقة ونزول في 30 ميكرولتر من RNase خالية H2O.ملاحظة: بدلاً من ذلك، استخدم أي بروتوكول استخراج RNA من اختيار (على سبيل المثال، نظام يستند إلى عمود). إذا تم تضمين هضم DNase في البروتوكول، تخطي في الخطوة التالية (الخطوة 1.3). قياس تركيز الحمض النووي الريبي (على سبيل المثال، مع استخدام مقياس الطيف) وهضم 20 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مع DNase.ملاحظة: الحمض النووي غني بـM 5C ولا يميز الجسم المضاد بين الحمض النووي والحمض النووي الريبي. في رد فعل DNase نموذجي، علاج 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في 50 ميكرولتر التفاعل. اخلط المكونات التالية وحضن رد الفعل (المكونات) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة:10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي X μL10x DNase العازلة 5 μLDNase 1 μL (2 وحدة)RNase خالية H2O تصل إلى 50 ميكرولتر إزالة إنزيم إما عن طريق إضافة حجم مناسب من كاشف التنشيط DNase (إذا تم تضمينه في مجموعة DNase ووفقا لتعليمات الشركة المصنعة) أو عن طريق تنفيذ خطوة تنظيف (على سبيل المثال، تنقية العمود أو استخراج الفينول / الكلوروفورم). تحقق من جودة ونقاء الحمض النووي الريبي المعزول بواسطة الكهرباء الشعرية والبدء في حالة ارتفاع عدد الـ RNA (RIN) عن 7، لضمان جودة العينات. اختياري: إزالة الحمض النووي الريبي لإثراء العينات في محتوى مرنا باستخدام طقم إزالة rRNA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. استخدام الحمض النووي الريبي DNase المعالجة من الخطوة السابقة لتفاعل استنفاد RRNA(ق). تنفيذ ردود فعل متعددة إذا كان المبلغ من الجيش الملكي النيبالي الإجمالي هو أكثر من الحد الأقصى للمبلغ المقترح لرد فعل. لاحظ أنه سيتم استرداد 5-10٪ فقط من كمية الإدخال بعد استنفاد RRNA. المضي قدما في الجيش الملكي النيبالي المستنفد (كمية متساوية لجميع العينات) وتجاهل المبالغ المذكورة في الخطوات التالية، لأنها تشير إلى الجيش الملكي النيبالي الكلي.ملاحظة: لمقارنة ووصف أساليب استنفاد RRNA المتاحة انظر المراجع 38,39,40. rRNA هو الجزء الرئيسي من مجموع الحمض النووي الريبي وهو m5C الميثيليد في العديد من الكائنات الحية. إعداد مقدما في المحاضر في المختبر (IVT) لاستخدامها كمتسلسلات الحمض النووي الريبي التحكم وإضافتها في العينات. إنتاج اثنين من IVTs متميزة باستخدام مجموعة النسخ في المختبر، واحدة مع النيوكليوسيدات غير الميثيلية، واحدة حيث يتم استبدال rCTP من قبل 5-ميثيل rCTP، لتكون بمثابة ضوابط سلبية وإيجابية في MeRIP، على التوالي. وكانت المحاضر التي أعدت من EGFP ورينيلا لوسيفراز.ملاحظة: يجب أن لا توجد الـ IVTs في نسخة الكائن الحي الذي تقوم بتحليله. إذا كانت القوائم IVTs من نفس القالب (على سبيل المثال، كلا من EGFP)، ثم إضافة التحكم الإيجابي والسلبي في عينتين مختلفتين. إذا كان تسلسلها مختلفاً (على سبيل المثال، EGFP وRenilla)، يمكن إضافتها إلى نفس العينة. ارتفاع في كل عينة 0.1 نغ IVT لكل 3 ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي، والضوابط. سونيكات الجيش الملكي النيبالي إلى ما يقرب من 100 NT شظايا.ملاحظة: يجب تعديل شروط القص RNA مقدما وأنها تختلف عن كل sonicator. للنموذج المستخدم هنا، يتم تنفيذ سونيكيشن مع الشروط التالية: ذروة السلطة 174، عامل الواجب 10، دورات / انفجار 200، 17 دقيقة. Sonicate نفس الكمية من RNA لجميع العينات، على الأقل 12 ميكروغرام RNA لكل عينة في 80 ميكرولتر من الحجم الإجمالي (دقيقة 60 ميكرولتر، ماكس 100 ميكرولتر)، مليئة RNase خالية H2O. تأكيد كفاءة سونيكيشن وتركيز عينات الحمض النووي الريبي بواسطة الكهربائي الشعري. يجب أن يكون متوسط حجم الحمض النووي الريبي المجزأ حوالي 100 nt. 2. ميثييل الحمض النووي الريبي المناعي (MeRIP) في أنابيب منخفضة الربط، إضافة 9 ميكروغرام من RNA سونيكاتيد وRNase خالية H2O تصل إلى 60 ميكرولتر (أو أكثر، اعتمادا على التركيز). افصل الهياكل الثانوية عن طريق تسخين RNA في 70 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 10 دقيقة وتبريد لمدة 10 دقيقة إضافية في مزيج الماء المثلج. تقسيم العينة إلى ثلاثة أجزاء: يتم حفظ ثلث (20 ميكرولتر، إذا تم أخذ 60 ميكرولتر في الخطوة 2.1) في أنبوب منفصل في -80 درجة مئوية كعينة الإدخال. تعبئة المتبقية 40 ميكرولتر مع RNase خالية H2O تصل إلى 860 ميكرولتر ثم انقسمت إلى اثنين من أنابيب منخفضة الربط: واحد لIP واحد للتحكم وهمية (430 μL لكل منهما). أضف إلى كلا الأنابيب:50 ميكرولتر من 10x MeRIP العازلة10 ميكرولتر من مثبطات RNase10 ميكرولتر من الأجسام المضادة α-m5C (10 ميكروغرام) في عينة IP لكل 10 ميكرولتر من H2O في العينة الوهميةملاحظة: لم يعد استنساخ الأجسام المضادة المستخدمة سابقاً متوفراً تجارياً بعد الآن. ومع ذلك، ينبغي أن تعمل أي المضادة 5-ميثيلسيتوسين أحادية النسيلة الجسم بشكل مماثل. يجب اختبار الأجسام المضادة لخصوصية قبل استخدامها لـ MeRIP11,23. ختم الأنابيب مع parafilm واحتضان لمدة 12-14 ساعة في 4 درجة مئوية، مع دوران النفقات العامة. في اليوم التالي، وإعداد البروتين G الخرز المغناطيسي للربط. لكل أنبوب (إما IP أو التحكم وهمية)، استخدم 40 ميكرولتر من الخرز. إضافة المبلغ الإجمالي من الخرز (# من أنابيب × 40 ميكرولتر، على سبيل المثال، بالنسبة لـ 2 IP و 2 عينات وهمية، هناك حاجة إلى 160 ميكرولتر من الخرز) في أنبوب 15 مل واغسل ثلاث مرات مع 800 ميكرولتر من 1x MeRIP العازلة لكل عينة (# من أنابيب x 800 ميكرولتر العازلة، على سبيل المثال، 3.2 مل ل2 IP و 2 عينات وهمية). أداء يغسل في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق مع دوران النفقات العامة، وجمع الخرز بمساعدة رف المغناطيسي والتخلص من العازلة الغسيل. بعد الغسيل الثالث، resuspend الخرز في نفس حجم 1x MeRIP العازلة والحجم الأولي من الخرز التي اتخذت (# من أنابيب × 40 ميكرولتر، على سبيل المثال، 160 ميكرولتر من 1x MeRIP العازلة ل2 IP و 2 عينات وهمية).ملاحظة: يتم تحديد كمية الخرز البروتين G المستخدمة من خلال القدرة ملزمة من الخرز لنوع الأجسام المضادة محددة وكمية الأجسام المضادة المستخدمة. في هذه الحالة، والخرز لديها قدرة ملزمة من حوالي 8 ميكروغرام من الفأر IgG لكل ملغ من الخرز و 30 ملغ / مل تركيز. ولذلك، 40 ميكرولتر كافية لربط ما يقارب 9.6 ميكروغرام من الأجسام المضادة. إضافة 40 ميكرولتر من حبات resuspended لكل عينة الملكية الفكرية وهمية واحتضان لمدة 2 ساعات إضافية في 4 درجة مئوية، مع دوران النفقات العامة. ضع الأنابيب على رف مغناطيسي لمدة 1 دقيقة وتجاهل المابير أو احفظها كتحكم (عينة RNA غير مرتبطة). غسل الخرز 5 مرات عن طريق إعادة الإنفاق في 700 ميكرولتر من 1x MeRIP العازلة الموردة مع 0.01٪ توين 20 والاحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع دوران النفقات العامة. Resuspend الخرز غسلها في 200 ميكرولتر من البروتينات K العازلة الهضم وإضافة 3.5 μL من البروتينات K. احتضان لمدة 3 ساعات في 50 درجة مئوية، تهتز في 800 دورة في الدقيقة. أحيانا، نفض الغبار يدويا الجزء السفلي من الأنبوب إذا كان الرواسب من الخرز تتشكل أثناء الحضانة. استخراج RNA بإضافة 800 ميكرولتر من مُكشف استخراج الحمض النووي الريبي (RNA) واتباع بروتوكول استخراج الـ thiocyanate-الفينول-الكلوروفورم الحمضية، ومتابعة البروتوكول كما هو الحال في الخطوة 1.2. لزيادة رؤية بيليه RNA، يمكن إضافة ملونة في الإيزوبروبانول في خطوة هطول الأمطار. إعادة بناء بيليه في 20 ميكرولتر من RNase خالية H2O (أو يساوي حجم المدخلات المحفوظة في الخطوة 2.3). 3- تحليل المصب إرسال عينات الإدخال و IP لتسلسل نهاية واحدة مع 50 قاعدة قراءة طول (SE50). تقليم 3 ‘نهاية محولات باستخدام cutadapt41 وتجاهل القراءات التي هي أقصر من 48 NT. خريطة قلصت يقرأ إلى الجينوم Arabidopsis (TAIR10 الشرح التوضيحي) باستخدام ستار42 مع قطع من 6 ٪ لعدم التطابق والحد الأقصى لحجم intron 10 كيلو بايت. احتفظ بقراءة معينة بشكل فريد لمزيد من التحليل. تحديد شظايا الحمض النووي الريبي المخصب في عينات IP مقارنة مع الإدخال باستخدام طريقتين متميزتين والنظر في تلك التي تم العثور عليها المخصب بشكل كبير من قبل كل. أولاً، الكشف عن قمم MeRIP-seq باستخدام MACS2 ذروة المتصل43 على المتكاملة المجمعة مقابل الإدخال. ثانياً، اتبع التحليل لذروة MeRIP-seq كما هو موضح في ماير وآخرون22 ويانغ وآخرون17. باستخدام البرامج النصية R المخصصة، تقسيم الجينوم في نوافذ 25 NT متميزة و حساب عدد من القراءات المعينة بشكل فريد لكل نافذة استناداً إلى موضع النيوكليوتيدات المعينة آخر (منذ أن يأتي القراءات من 100 nt RNA أجزاء). حساب النوافذ المخصب بشكل كبير في عينات IP مقارنة مع الإدخال مع اختبار دقيق فيشر. استخدم الإجراء بنياميني-هوشبرغ لتصحيح لاختبارات متعددة. الحفاظ على القمم المخصب بشكل كبير التي تمتد على ما لا يقل عن نافذتين متتاليتين وتجاهل القمم التي تغطي نافذة واحدة فقط. تحديد المناطق المشروحة من الجينوم (النصوص) مع قمم المخصب بشكل كبير وجدت من خلال كلا الأسلوبين. بدلاً من ذلك أو بشكل تكميلي، اختبار أهداف محددة للرنا لإثراءها في عينات الملكية الفكرية. عكس نسخ RNA (نفس حجم الإدخال، IP وعينات وهمية) مع hexamers عشوائية. تنفيذ كمية في الوقت الحقيقي PCR على الأهداف المختارة، مقارنة المدخلات، الملكية الفكرية وسخري عبر طريقة ΔCt.ملاحظة: يجب أن لا يكون المنتج الذي تم إنشاؤه أطول من 100 bp، لأن هذا هو متوسط حجم التجزئة.

Representative Results

يتم توفير مخطط للأسلوب في الشكل 1. الخطوات الحاسمة الأولى من البروتوكول هي الحصول على RNA ذات نوعية جيدة (RIN ≥ 7) و sonicate إلى ما يقرب من 100 شظايا NT. يتم فحص كفاءة كلتا الخطوتين بواسطة آلة كهرباء شعرية قائمة على الرقائق. في الشكل 2A، يتم عرض تشغيل ممثل لعينة من الحمض النووي الريبي جيدة. يتم تخفيف العينة 1:10 قبل التحميل على رقاقة من أجل أن يكون التركيز الذي هو في نطاق الكشف عن مجموعة المستخدمة (5-500 نانوغرام /ميكرولتر). يتم تشغيل نفس العينة أيضا بعد سونيكيشن ويظهر في الشكل 2B. لاحظ وجود ذروة موحدة واحدة تحولت إلى يسار الرسم البياني، في حجم حوالي 100 نووكليوتيدات. وينجم التركيز الأدنى عن فقدان الحمض النووي الريبي أثناء التشظي، ولكن أيضا بسبب زيادة حجم العينات (60-100 ميكرولتر، الخطوة 1.7.1). ويمكن تقييم نوعية العينات IP و وهمية من قبل qRT-PCR. وتحقيقا لهذه الغاية، فإن IVTs ارتفعت في بمثابة ضوابط إيجابية وسلبية: IVT الميثيل، حيث في جميع وظائف السيتوسين هناك م5C، ومن المتوقع أن تكون غنية للغاية في عينة الملكية الفكرية؛ على العكس من ذلك، لا ينبغي أن يكون IVT غير الميثيلية فرقا بين الملكية الفكرية وSys. يتم سرد التمهيديات المستخدمة في مقايسة qRT-PCR لاثنين من التحكم IVTs(EGFP وRenilla luciferase) في الجدول 1. في الواقع، كما هو مبين في الشكل 3،تم استرداد حوالي 80٪ من IVT الميثيلية في عينة IP، وفقط ما يقرب من 2٪ في موك. بالنسبة للتحكم غير الميثيلي، كان الانتعاش أقل من 1٪ في كل من عينات IP و Mock. وهذا يتحقق من كفاءة MeRIP التي تم تعجيلها وإثراء شظايا الحمض النووي الريبي الميثيلي، وهو مؤشر جيد على أن العينات يمكن استخدامها لتحليل المصب. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق الإثراء الطّي لـ IVT غير الميثيلية (نسبة الملكية الفكرية إلى السخرية) كعتبة لتقدير أهمية الإثراء في مقايسات qRT-PCR. بعد محاذاة القراءة إلى الجينوم(الشكل 4)، يتم تطبيق خوارزميات الاستدعاء الذروة الموضحة في الخطوتين 3.4.1 و 3.4.2 لتحديد النوافذ ذات الأهمية الإحصائية ، المخصب في عينات IP مقارنة بالمدخلات. التسلسلات التي تتوافق مع هذه النوافذ يمكن استخدامها أكثر، على سبيل المثال للبحث عن الزخارف ذات الصلة الميثيل المحفوظة11،17. الشكل 1: التمثيل التخطيطي لبروتوكول MeRIP-seq.يتم احتضان عينات الحمض النووي الريبي مع جسم مضاد للسيتوسين 5 ميثيل ويتم سحب المجمعات إلى أسفل مع الخرز المغناطيسي البروتين G التي التقاط الأجسام المضادة جنبا إلى جنب مع الجيش الملكي النيبالي ملزمة. يتم تحليل عينات الحمض النووي الريبي المائلة عن طريق التسلسل العميق وqRT-PCR. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: نتائج تمثيلية من تحليل جودة عينات الحمض النووي الريبي.(A) ملف تعريف تمثيلي لعينة مصنع RNA الكلي المؤهل. (B) الملف الشخصي تمثيلي لعينة RNA بعد صوتنة إلى 100 nt شظايا. إخراج الملفات من برنامج الكهرباء الشعرية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: تحليل qRT-PCR لدقات التحكم IVTs.واستخدمت النصوص الميثيلات وغير الميثيلية في المختبر كضوابط إيجابية وسلبية على مقايسة MeRIP، على التوالي. بعد الاعون المناعية، يتم إثراء IVT الميثيلي عاليا في عينة IP (الأخضر) ولكن ليس في العينة وهمية (دون المضادة ل M5C الأجسام المضادة؛ الأرجواني). ولم تُظهر الـ IVT غير الميثيلية أي إثراء ولا فرق بين الملكية الفكرية والـ”موك”. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: قراءة المحاذاة قبل وبعد MeRIP حول نسخة تمثيلية.يقرأ محاذاة إلى نص معين في نموذج الإدخال (الصف العلوي) وفي نسخ IP اثنين (الصف الأوسط والسفلي). يُظهر الصندوق الأسود نافذة طويلة تم تحديدها 50 nt على أساس MACS243 و MeRIP-seq22 تحليلات ذروة الدعوة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الهدف زوج التمهيدي تسلسل المنتج طول المنتج EGFP ل: 5 ‘- GGCAACTACAAGACCCGCCC -3′ GGCAACTACAAGACGCGCCGGGGGGGTGAAGTTCGAGGGCGACCCTGGTGAACCGCGAGCTGAGGGC 72 نقطة أساس القس: 5′- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3’ رينايلا لوسيفراز ل: 5 ‘- GGAGAATAACTTCTGTGGAAAC -3’ GGAGAATAACTTCTGTGGAAACCATGTTGCCATCAAAATCATGAGAAAGTTAGAACCAGAAGATGGC 75 نقطة أساس القس: 5 ‘- GCTGCAAATTCTCTGGCTAA -3’ الجدول 1: معلومات عن ال التمهيديات والمنتجات التي تم إنشاؤها لتحليل qRT-PCR. وصفات العازلة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

الجيش الملكي النيبالي يحمل أكثر من مائة التعديلات قاعدة متميزة4 التي تشكل epitranscriptome44. وتضيف هذه التعديلات طبقة إضافية من تنظيم الترجمة والإشارات (تمت مراجعتها في5و6و8و20و45و46). وقد تمكنت الدراسات المبكرة من الكشف عن وجود تعديلات ما بعد النسخ على RNA28،47 ولكن لا بد من تحديد الحمض النووي الريبي المعدلة المحددة من أجل فهم دور epitranscriptomics. تم تصميم MeRIP كوسيلة لرسم خريطة مواقع RNA methylation transcriptome واسعة21،22. ويمكن تكييفها مع أي تعديل، إذا كان هناك جسم مضاد معين متاح.

القوة الرئيسية لهذا البروتوكول هو أن بسيطة نسبيا، آمنة للرنا والمستعمل (على سبيل المثال، 5-azaC هو شديد السمية للنباتات والبشر) ولا تتطلب تسلسل أو تعديل المعلومات الإنزيم. وعلاوة على ذلك، فإن إثراء الحمض النووي الرنا الميثيل بواسطة بروتوكول الإنترنت يزيد من فرص اكتشاف الحمض النووي الرنا الصغير الزفير المنخفض، على عكس تسلسل ثنائي الفقار الذي لا يحتوي على خطوة إثراء. عندما يتم تنفيذ جولتين تسلسليتين من MeRIP، فإن الإثراء في شظايا الحمض النووي الريبي التي تحتوي على مواقع المثيلات يزيد أكثرمن 22. واحدة من القيود من MeRIP، وخاصة عندما تطبق على دراسات الميثيل مرنا، هو كمية عالية من الحمض النووي الريبي المطلوبة كمدخلات للمقايسة. سوف ريبوديبليشن – أو بولي (A) التخصيب – خطوة تقليل الخلفية الناجمة عن الحمض النووي الريبي المعدلة بشكل كبير ولكنه يزيل أكثر من 90٪ من إجمالي RNA. يجب أيضا إزالة الحمض النووي تماما كما هو غني في السيتوسينات 5 ميثيل. عيب آخر هو دقة أقل من الموضع الدقيق للميثيل. سونيكيشن من الجيش الملكي النيبالي قبل الحضانة مع الأجسام المضادة يساعد نحو هذا الاتجاه عن طريق تضييق المنطقة التي تحتوي على تعديل إلى 100-200 النيوكليوتيدات. عندما يتم دمج MeRIP مع تسلسل عميق، تزداد دقة التنبؤ بموقع m5C كلما شكل تسلسل يقرأ توزيعًا غوسيًا حول موقع المثيلات المحتمل. بالإضافة إلى ذلك ، خصوصية الأجسام المضادة تحتاج إلى تأكيد قبل الفحص (على سبيل المثال ، مع RNA dot لطخة المقايسة ، التي يتم تنفيذها مع oligos توليفها مع النيوكليوتيدات المعدلة) ، ومع ذلك ، إلى أي مدى يمكن أن يميز الجسم المضاد في الواقع بين التعديلات ذات الصلة الوثيقة (على سبيل المثال ، m6A و M6Am) هي نقطة وسيطة في الحقل48،49. وعلاوة على ذلك، قد تتداخل الحمض النووي الريبي (RNAs) ذات البنية العالية مع تفاعل المستضد المضاد للجسم، وهو قيد آخر يتم تناوله في الغالب بتجزئة الحمض النووي الريبي النووي (RNA) وdenaturationه قبل IP. على العكس من ذلك، فإن تسلسل البيسولفيت الذي يتأثر أيضا بالهياكل الثانوية، لا يشمل خطوة تجزئة وقد يكون هذا أحد الأسباب التي تسبب التناقض بين مواقع m5C و mRNAs التي تنبأ بها تسلسل ثنائيفوليت16 وميريب-seq11،17. تعديلات أخرى من السيتوسين (على سبيل المثال، hm5C) هي أيضا مقاومة ل deamination بوساطة ثنائي الفقار35.

وتشمل التعديلات من برنامج MeRIP- seq خطوة الربط، إما مع إدخال ribonucleoside قابل للانعاض الضوئي (الصورة crosslinking بمساعدة م6A-seq، PA-M6A-seq 50) أو استخدام الأشعة فوق البنفسجية لإنشاء الأجسام المضادة-RNA عبر بعد IP (miCLIP49،طريقة مختلفة من miCLIP الموصوفة في مقدمة30،ولكن أيضا مع دقة النيوكليوتيد الفردية). في المستقبل، ومع تراكم المعرفة بشأن ميثيل الحمض النووي الريبي، قد يكون من الأفضل اتباع نهج أكثر استهدافاً، استناداً إلى الإنزيمات التعديلية و/أو تسلسل التوافق في الآراء حيث يظهر الميثيل. تحديد البروتينات القارئ ضروري لفهم وظيفة الجزيئية والتشوير من التعديلات ما بعد النسخ. تكنولوجيا تسلسل النانوبور تسمح بالفعل التحديد المباشر للنيوكليوتيدات المعدلة دون معالجة مسبقة للرنا17 ولكن لا يزال هناك مجال للتحسين في هذا المجال فيما يتعلق بعمق التسلسل والتحليل الحيوي. بشكل عام، MeRIP-seq هو حاليا نهج راسخ وموثوق به وغير متحيز لتحديد نسخ الحمض النووي الريبي الميثيل.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من قبل راتب دكتوراه IMPRS إلى E.S، زمالة طويلة الأجل EMBO لV.P.، و MPI-MPP الأموال الداخلية لF.K. تم تمويلها أيضا من خلال PLAMORF، وهو المشروع الذي تلقى التمويل من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج الاتحاد الأوروبي آفاق 2020 البحث والابتكار (اتفاقية منحة رقم 810131). يود المؤلفون أن يشكروا فيديريكو أبيلت على التحليل البيولوجي للمعلوماتية والتعليقات على المخطوطة، وماثيو باهين وأميرة كرامدي على التحليل البيولوجي للمعلوماتية.

Materials

α‐m5C antibody ZymoResearch A3001 (discontinued), A3002 available Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available
Chip and reagents for capillary electrophoresis Agilent 5067-1511 RNA 6000 Nano kit
Dnase Ambion AM1907 TURBO DNA-free kit
Co-precipitant of nucleic acids Ambion AM9515 Glycoblue, 15 mg/mL
In vitro transcription kit Promega P1300 T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System
Low-binding reaction tubes Kisker Biotech G017 1.7 ml microcentrifuge tubes
Protein G magnetic beads Invitrogen 10003D Dynabeads Protein G
Proteinase K Ambion AM2546 20mg/mL stock solution, RNA grade
RNase inhibitor Promega N2615 RNasin Plus 40 U/μl
rRNA removal kit Epicentre RZPL11016 Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)
Sonication tubes Covaris 520045 microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm
RNA extraction reagent Ambion 15596018 TRIzol reagent
Equipment
Capillary electrophoresis machine Agilent G2939BA 2100 Bioanalyzer System
Magnetic rack Invitrogen 12321D DynaMag-2
Microentrifuge Eppendorf discontinued 5417R model
Rotator Benchmark R4040 RotoBot Mini
Sonicator Covaris 500217 S220 Focused-ultrasonicator
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONEC-W NanoDrop OneC
Waterbath GFL 1012 1012 Incubation bath
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trixl, L., Lusser, A. The dynamic RNA modification 5-methylcytosine and its emerging role as an epitranscriptomic mark. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), 1-17 (2019).
  2. Mongan, N. P., Emes, R. D., Archer, N. Detection and analysis of RNA methylation. F1000Research. 8, 559 (2019).
  3. Cantara, W. A., et al. The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update. Nucleic Acids Research. 39, 195-201 (2011).
  4. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (1), 303-307 (2018).
  5. Agris, P. F. Bringing order to translation: the contributions of transfer RNA anticodon-domain modifications. EMBO reports. 9 (7), 629-635 (2008).
  6. Chow, C. S., Lamichhane, T. N., Mahto, S. K. Expanding the Nucleotide Repertoire of the Ribosome with Post-Transcriptional Modifications. ACS Chemical Biology. 2 (9), 610-619 (2007).
  7. Gigova, A., Duggimpudi, S., Pollex, T., Schaefer, M., Koš, M. A cluster of methylations in the domain IV of 25S rRNA is required for ribosome stability. RNA. 20 (10), 1632-1644 (2014).
  8. Motorin, Y., Helm, M. tRNA Stabilization by Modified Nucleotides. Biochemistry. 49 (24), 4934-4944 (2010).
  9. Shatkin, A. Capping of eucaryotic mRNAs. Cell. 9 (4), 645-653 (1976).
  10. Shen, L., et al. N 6 -Methyladenosine RNA Modification Regulates Shoot Stem Cell Fate in Arabidopsis. Developmental Cell. 38 (2), 186-200 (2016).
  11. Cui, X., et al. 5-Methylcytosine RNA Methylation in Arabidopsis Thaliana. Molecular Plant. 10 (11), 1387-1399 (2017).
  12. Huber, S. M., et al. Formation and abundance of 5-hydroxymethylcytosine in RNA. ChemBioChem. 16 (5), 752-755 (2015).
  13. Zuber, H., et al. Uridylation and PABP Cooperate to Repair mRNA Deadenylated Ends in Arabidopsis. Cell Reports. 14 (11), 2707-2717 (2016).
  14. Luo, G. Z., et al. Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana. Nature Communications. 5 (1), 5630 (2014).
  15. Wan, Y., et al. Transcriptome-wide high-throughput deep m6A-seq reveals unique differential m6A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana. Genome Biology. 16 (1), 1-26 (2015).
  16. David, R., et al. Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs. The Plant Cell. 29 (3), 445-460 (2017).
  17. Yang, L., et al. m5C Methylation Guides Systemic Transport of Messenger RNA over Graft Junctions in Plants. Current Biology. 29 (15), 2465-2476 (2019).
  18. Sun, L., et al. Transcriptome-wide analysis of pseudouridylation of mRNA and non-coding RNAs in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 70 (19), 5089 (2019).
  19. Chmielowska-Bąk, J., Arasimowicz-Jelonek, M., Deckert, J. In search of the mRNA modification landscape in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 421 (2019).
  20. Liang, Z., Riaz, A., Chachar, S., Ding, Y., Du, H., Gu, X. Epigenetic Modifications of mRNA and DNA in Plants. Molecular Plant. 13 (1), 14-30 (2020).
  21. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  22. Meyer, K. D., et al. Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3′ UTRs and near Stop Codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  23. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m5C within archaeal mRNAs. PLoS genetics. 9 (6), 1003602 (2013).
  24. Dominissini, D., et al. The dynamic N1-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
  25. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N1-methyladenosine methylome. Nature Chemical Biology. 12 (5), 311-316 (2016).
  26. Hotchkiss, R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. Journal of Biological Chemistry. 175 (175), 315-332 (1948).
  27. Wyatt, G. R. Occurence of 5-Methyl-Cytosine in Nucleic Acids. Nature. 166, 237-238 (1950).
  28. Dubin, D. T., Taylor, R. H. The methylation state of poly A-containing- messenger RNA from cultured hamster cells. Nucleic Acids Research. 2 (10), 1653-1668 (1975).
  29. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1-16 (2017).
  30. Hussain, S., et al. NSun2-mediated cytosine-5 methylation of vault noncoding RNA determines its processing into regulatory small RNAs. Cell Reports. 4 (2), 255-261 (2013).
  31. Khoddami, V., Cairns, B. R. Identification of direct targets and modified bases of RNA cytosine methyltransferases. Nature biotechnology. 31 (5), 458-464 (2013).
  32. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  33. Yang, X., et al. 5-methylcytosine promotes mRNA export – NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27 (5), 606-625 (2017).
  34. Burgess, A., David, R., Searle, I. R. Conservation of tRNA and rRNA 5-methylcytosine in the kingdom Plantae. BMC Plant Biology. 15 (1), 199 (2015).
  35. Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing. Nucleic Acids Research. 37 (2), (2009).
  36. Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nature Genetics. 37 (8), 853-862 (2005).
  37. Auxilien, S., Guérineau, V., Szweykowska-Kulińska, Z., Golinelli-Pimpaneau, B. The human tRNA m (5) C methyltransferase Misu is multisite-specific. RNA Biology. 9 (5), 1331-1338 (2012).
  38. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
  39. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterial biofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7 (1), 41114 (2017).
  40. Huang, Y., Sheth, R. U., Kaufman, A., Wang, H. H. Scalable and cost-effective ribonuclease-based rRNA depletion for transcriptomics. Nucleic Acids Research. 48 (4), 20 (2020).
  41. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  42. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  43. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), 137 (2008).
  44. Saletore, Y., et al. The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications. Genome Biology. 13 (10), 175 (2012).
  45. Schwartz, S. Cracking the epitranscriptome. RNA. 22 (2), 169-174 (2016).
  46. Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2016).
  47. Keith, G. Mobilities of modified ribonucleotides on two-dimensional cellulose thin-layer chromatography. Biochimie. 77 (1-2), 142-144 (1995).
  48. Feederle, R., Schepers, A. Antibodies specific for nucleic acid modifications. RNA Biology. 14 (9), 1089-1098 (2017).
  49. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  50. Chen, K., et al. High-Resolution N 6 -Methyladenosine (m 6 A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m 6 A Sequencing. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).

Tags

Methylated RNA ImmunoprecipitationMeRIPRNA ModificationTranscriptomeArabidopsisRNA ExtractionGuanidine ThiocyanateAcid Phenol1-bromo-3-chloropropaneIsopropanolSodium AcetateEthanolDNaseRNA Integrity NumberIn Vitro TranscriptSonication

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (159), e61231, doi:10.3791/61231 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image