シロイヌナズナの^m5C修飾を研究するメチル化RNA免疫沈降アッセイ

1. RNAの準備 200mgの植物組織を液体窒素で粉末状に粉砕し、手順全体を通して組織が凍結したままであることを確認します。 酸グアニジニウムチオシアネートフェノール-クロロホルム抽出プロトコルに従って所望の植物組織からRNAを抽出します。相分離中にRNAをDNAで汚染する可能性を減らすには、クロロホルムの代わりに1-ブロモ-3-クロロプロパンを使用してください。 グアニジンチオシアネートと酸フェノールを含むRNA抽出試薬を1mL加え、粉砕した植物組織(100mg組織あたり500μL)を加える。反転してよく混ぜ、すべての組織が濡れているかどうかを確認します。室温で10分間インキュベートし、リボヌクレオプロテイン複合体を解約する。 4°Cで12,000 x g で10分間遠心分離機を使用し、上清を新しい1.5 mLチューブに移します。 1-ブロモ-3-クロロプロパン(500 μL RNA抽出試薬あたり100 μL)とボルテックスを200 μL激しく加えます。 遠心分離機は4°Cで12,000 x g で15分間、上水相(約500μL)を新しい1.5 mLチューブに移します。 イソプロパノール(500μL)1ボリューム、3M酢酸ナトリウムpH5.5(50μL)の0.1容量を加え、反転して10分を-20°Cで沈殿させることでよく混ぜます。注: RNA沈殿を高めるために酢酸ナトリウム(NaOAc)の使用をお勧めします。このプロトコルは、数時間または一晩にわたってRNAの沈殿を延長することによって、この時点で一時停止することができます。 4°Cで12,000xgで30分間遠心分離機を出し、上清を捨てます。 ペレットを80%のEtOHの500 μLで2回洗浄し、遠心分離機を4°Cで12,000 x g で5分間洗浄し、廃棄します。 ペレットを500 μL 99%のEtOHで1回洗浄し、遠心分離機を4°Cで12,000 x g で5分間洗浄し、廃棄します。 ペレットを5~10分間乾燥させ、RNaseフリーH2Oの30μLに溶解します。注: 代わりに、任意の RNA 抽出プロトコル (カラムベースのシステムなど) を使用します。DNase のダイジェストがプロトコルに含まれている場合は、次の手順でスキップします (ステップ 1.3)。 RNA濃度を測定し(分光光度計を使用して)、DNaseでRNAを20μg消化します。注:DNAはm5Cに富んでおり、抗体はDNAとRNAを区別しません。 典型的なDNase反応では、10μgのRNAを50μL反応で処理します。以下の成分を混合し、37°Cで30分間反応をインキュベートします。10 μg の RNA x μL10x DNaseバッファ5 μLDNase 1 μL (2単位)RNaseフリーH2O最大50 μL 適切な量のDNase不活性化試薬を添加するか(DNaseキットに含まれている場合、製造元の指示に従って)、またはクリーンアップ手順(例えば、カラム精製またはフェノール/クロロホルム抽出)を行うことにより、酵素を除去します。 毛細管電気泳動により単離されたRNAの品質と純度を確認し、RNA完全性数(RIN)が7より高い場合に進み、サンプルが良好な品質であることを確認します。 オプション:リボソームRNAを除去し、rRNA除去キットを使用し、製造業者のプロトコルに従ってmRNA含有量のサンプルを濃縮します。 rRNAの枯渇反応のために前のステップからDNase処理されたRNAを使用してください。RNAの総量が反応に示唆された最大量を超える場合は、複数の反応を行う。 なお、rRNA枯渇後に回収されるのは、入力量の5~10%に過ぎないことに注意してください。rRNAが枯渇したRNA(全サンプルの量)を続行し、合計RNAを指すため、以下のステップで言及されている量を無視します。注: 使用可能な rRNA 枯渇方法の比較と説明については、参照38,39,40を参照してください。rRNAは、総RNAの主要な部分であり、多くの生物で5Cメチル化されています。 コントロールRNA配列として使用するインビトロ転写物(IVT)を事前に準備し、サンプルに追加します。 インビトロ転写キットを使用して2つの異なるIVTを生成し、1つは非メチル化ヌクレオシドを有し、もう1つはrCTPが5-メチル-rCTPに置き換えられ、それぞれMeRIPで陰性および陽性の対照として機能する。調製された転写物は 、EGFP および レニラ ルシファーゼのものである。注:ITは、あなたが調べている生物のトランスクリプトームに存在してはいけません。もし、IVT が同じテンプレート(例えば、両方の EGFP)からのものなら、2 つの異なるサンプルに正と負のコントロールを加えます。それらの配列が異なる場合(例えば、EGFPとレニラ)、それらは同じサンプルに加えることができます。 各サンプルのスパイクは、コントロールとして、RNAの3μgあたり0.1 ng IVTあたり。 RNAを約100nt断片に超音波処理します。注:RNAせん断の条件は事前に調整する必要があり、それらは各超音波処理器によって異なります。ここで使用されるモデルの場合、超音波処理は、次の条件で行われます:ピーク電力174、デューティファクター10、サイクル/バースト200、17分。 全サンプルに対して同量のRNAを超音波処理し、サンプル当たり少なくとも12 μgのRNAを80 μLの総容積(最小60 μL、最大100 μL)で、RNaseフリーH2Oで満たします。 毛細管電気泳動により、超音波処理の効率とRNAサンプルの濃度を確認します。断片化したRNAの平均サイズは約100ntでなければなりません。 2. メチル化RNA免疫沈降(MeRIP) 低結合チューブでは、9 μgの超音波処理された RNA と RNase フリー H2O を 60 μL まで加えます(濃度に応じてそれ以上)。 水浴中のRNAを70°Cで10分間加熱し、氷水ミックスでさらに10分間冷却して二次構造を解約します。 サンプルを3つの部分に分割します:3分の1(ステップ2.1で60 μLを取った場合は20μL)を入力サンプルとして-80°Cの別のチューブに保存します。残りの40 μLをRNaseフリーH2Oで860 μLまで充填し、次にIP用とモックコントロール用(各430μL)の2つの低結合チューブに分割します。 両方のチューブに追加:50 μL の 10x MeRIP バッファ10 μL の RNase 阻害剤モックサンプル中のH2Oの10 μL当たりIPサンプルのα-m5C抗体(10 μg)の10 μL注:以前に使用した抗体クローンは、もはや市販されていません。しかし、任意の抗5-メチルシトシンモノクローナル抗体は、同様に動作する必要があります。抗体は、MeRIP11,23に使用する前に特異性についてテストする必要があります。 チューブをパラフィルムで密封し、4°Cで12〜14時間インキュベートし、頭上の回転を行います。 翌日、結合のためにプロテインG磁気ビーズを調製する。 各チューブ(IPまたはモックコントロール)に40 μLのビーズを使用します。15 mLチューブにビーズの合計量(例えば、2つのIPと2つのモックサンプルの場合は160 μLが必要)を15 mLチューブに加え、サンプルあたり800 μLの1x MeRIPバッファー(チューブx 800 μLバッファーの#、例えば、2.2mL、および2 IP 2およびIP 2)で3回洗浄します。 頭上の回転で5分間室温で洗浄を行い、磁気ラックの助けを借りてビーズを収集し、洗浄バッファーを廃棄します。3回目の洗浄後、ビーズを取り込んだビーズの初期量と同じ体積の1x MeRIPバッファ(例えば、1x MeRIPバッファの160 μLの160 μL、2つのIPおよび2つのMockサンプル)でビーズを再中断します。注:使用されるプロテインGビーズの量は、特定の抗体タイプのビーズの結合能と使用される抗体の量によって決定されます。この場合、ビーズは約8μgのマウスIgGのビーズ1mgおよび30mg/mL濃度の結合能力を有する。したがって、40 μL は約 9.6 μg の抗体を結合するのに十分です。 各IPおよびMockサンプルに40μLの再懸濁ビーズを加え、オーバーヘッド回転で4°Cでさらに2時間インキュベートします。 チューブを磁気ラックに1分間置き、上清を捨てるか、コントロール(非結合RNAサンプル)として保存します。 0.01%Tween 20に供給される1x MeRIPバッファーの700 μLで再懸濁し、オーバーヘッド回転で室温で10分間インキュベートしてビーズを5回洗浄します。 洗浄したビーズを200 μLのプロテイナーゼK消化バッファーに再懸濁し、3.5 μLのプロテナーゼ K. インキュベートを50°Cで3時間加え、800 rpmで振る。時折、インキュベーション中にビーズの堆積物が形成されている場合は、チューブの底部を手動でフリックします。 800μLのRNA抽出試薬を添加し、酸グアニジニウムチオシアネートフェノール-クロロホルム抽出プロトコルを添加してRNAを抽出し、ステップ1.2のように継続する。RNAペレットの視認性を高めるために、沈殿工程でイソプロパノールに着色共沈殿剤を添加することができる。RNaseフリーH2Oの20 μL(またはステップ2.3で保持される入力ボリュームと等しい)でペレットを再懸濁します。 3. ダウンストリーム解析 50 の底読み取り長さ (SE50) を持つシングル エンドシーケンスの入力および IP サンプルを送信します。 カットアダプト41 を使用してトリム3’エンドアダプタと48 nt未満の読み取りを破棄します。 ミスマッチの場合は6%、最大イントロンサイズは10 kbのSTAR42 を使用して、トリミングされた読み取りをシロイヌナズナシスゲノム(TAIR10アノテーション)にマッピングします。さらに分析するために、一意にマップされた読み取りを保持します。 2つの異なる方法を使用して入力と比較してIPサンプル中の濃縮されたRNA断片を同定し、両方によって有意に濃縮されたものを考慮する。 まず、プールされた IP と入力の MACS2 ピーク呼び出し元43 を使用して MeRIP-seq ピークを検出します。 第二に、マイヤーら22 およびヤンら17に記載されているMeRIP-seqピークコールの分析に従ってください。 カスタム R スクリプトを使用して、ゲノムを別の 25 nt ウィンドウに分割し、最後にマップされたヌクレオチドの位置に基づいて各ウィンドウの一意にマッピングされた読み取りの数をカウントします (読み取りは 100 nt RNA フラグメントから発生するため)。 フィッシャー正確検定で入力と比較して、IPサンプルで大幅に富んだウィンドウを計算します。 少なくとも 2 つの連続したウィンドウにまたがる大幅に豊かなピークを維持し、1 つのウィンドウだけをカバーするピークを破棄します。 両方の方法で見つかった有意に富んだピークを持つゲノムのアポイントトされた領域(トランスクリプト)を特定する。 または補完的に、特定のRNA標的のIPサンプル内の濃縮をテストします。 ランダムな六角形でRNA(入力、IP、モックサンプルの同じボリューム)を逆に書き起こします。 ΔΔCt法を用いて入力、IP、モックを比較して、選択したターゲットに対して定量的リアルタイムPCRを実行します。注: 生成された製品は、平均フラグメンテーションサイズであるため、100 bp 以下でなければなりません。