JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Метилированная РНК Иммунопреципиентация Анализ для изучения m5C Модификация в Arabidopsis

Published: May 14, 2020
doi:
10.3791/61231
, , ,
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, 2Department of Molecular Medicine, Medical School,University of Padua, 3Biologie de l’Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France

Summary

Анализ иммунопреципиентации метилированной РНК является методом на основе антител, используемым для обогащения метилированных фрагментов РНК. В сочетании с глубоким секвенированием, это приводит к идентификации стенограмм с модификациейm 5C.

Abstract

Вторичные базовые модификации РНК, такие как m5C, влияют на структуру и функцию модифицированных молекул РНК. Метилированная РНК Иммунопреципиентация и секвенирование (MeRIP-seq) является методом, который направлен на обогащение метилированной РНК и в конечном итоге определить измененные стенограммы. Короче говоря, sonicated РНК инкубируется антителом для 5-метилированных цитосинов и осаждается с помощью белка G шарики. Затем обогащаемые фрагменты секвенированы, а потенциальные места метилирования отображаются на основе распределения считывания и обнаружения пика. MeRIP может быть применен к любому организму, так как он не требует какой-либо предварительной последовательности или изменения знаний фермента. Кроме того, помимо фрагментации, РНК не подвергается никакой другой химической или температурной обработке. Тем не менее, MeRIP-seq не обеспечивает одноядеротидного прогнозирования участка метилирования, как это делают другие методы, хотя метилированная область может быть сужена до нескольких нуклеотидов. Использование различных модификаций специфических антител позволяет корректировать MeRIP для различных базовых модификаций, присутствующих на РНК, расширяя возможное применение этого метода.

Introduction

Во всех трех царствах жизни виды РНК подвергаются посттранскриптионным изменениям, и исследования этих функционально соответствующих биохимических модификаций называются «эпитранскриптомикой». Эпитранскриптомика является растущей области и различные методы разрабатываются для изучения и карты изменений на молекулы РНК(рассмотрены в 1,2). Обнаружено более сотни модификаций РНК, обнаруженных в РРНК, тРНК, других нкРНК, а такжемРНК 3,4. Хотя наличие и функция химически разнообразных пост-транскриптных модификаций в тРНК и РРНК широкоизучены 5,6,7,8,только недавно были охарактеризованы модификации мРНК. На заводах на сегодняшний день выявлено много модификаций мРНК, в томчисле м 7Гпри структуре крышки 9,м 1А 10,хм 5С11,12и уридилирование13. Тем не менее,только м 6A10,14,15,м 5C11,16,17, ипсевдоуридин 18 были нанесены на карту транскриптом всей в Arabidopsis. Пост-транскрипционные модификации базы мРНК участвуют в нескольких процессахразвития 19,20.

Одним из наиболее часто используемых подходов в эпитранскриптомике является метилированная РНК иммунопреципиентация в сочетании с глубоким секвенированием (MeRIP-seq). MeRIP-seq был разработан в 2012 году для изучениям 6А в клеткахмлекопитающих 21,22. Она требует использования антитела для желаемой модификации и направлена на обогащение для фрагментов РНК, несущих модифицированный нуклеотид (ы). Обычно за этим следует глубокое секвенирование для выявления и карты обогащенных фрагментов или количественных ПЦР для проверки конкретных целей РНК. Точность MeRIP основана на специфичности антитела для распознавания модифицированного нуклеотида над аналогичными модификациями (например, m5C и hm5C11,23). Помимом 6А, MeRIP-seq также применяется дляизучения м м 1Аи м 5С РНК метилирования внескольких организмах 11,17,23,24,25.

Метилирование цитозина в пятом положении углерода(m 5C) является наиболее распространенноймодификацией ДНК 26,27 и одной из наиболее распространенных модификацийРНК тоже 3,4. В товремя как m 5C был обнаружен в эукариотических мРНК в 1975году 28, только недавно исследования сосредоточены на отображении модификации транскриптома всей, в кодировании и некодирующих РНК11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.

Альтернативные методы,используемые в исследовании РНК m 5C, включают химическое преобразование не метилированных цитозинов в урацилы (секвенирование бисульфита) и иммунопреципиентные анализы, основанные на необратимой привязке известной РНК цитозин метилтрансферазы к целям РНК (miCLIP, aza-IP). Короче говоря, секвенирование бисульфита использует особенность 5-метилированного цитозина, чтобы быть устойчивым к лечению бисульфита натрия, который deaminates неизмененных цитозинов к uracil. Метод был впервые разработан для ДНК, но адаптированы для РНК тоже и многие исследования выбралиэтот подход для обнаружения м 5C сайтов вРНК 16,23,29,32,34,35. Как miCLIP, так и aza-IP требуют соблюдения цитозин-метилтрансферазы РНК и использования соответствующих антител. В случае miCLIP (метилирование индивидуального нуклеотида-разрешения перекрестного и иммунопреципиентации), метилтрансфераза несет в себе одну аминокислотную мутацию так, что она связывается с субстратом РНК, но не может бытьвыпущена 30. В аза-IP (5-азацитидин-опосредованное иммунопреципиентирование РНК), необратимое связывание образуется между 5-azaC нуклеозида и РНК цитозин метилтрансферазы, когда экзогенно при условии 5-azaC включен РНК-полимеразы в целевуюмолекулу РНК 31.

Основным преимуществом этих трех методов является то, что они позволяют одно нуклеотидное разрешение отображением 5С. Кроме того, miCLIP и aza-IP предоставляют информацию о конкретных целях выбранной РНК цитозин метилтрансферазы, расшифровывают более глубокий механизм и роль посттранскриптионных модификаций РНК. Тем не менее, подход MeRIP-seq может определить транскриптомавсей м 5C регионов без каких-либо предыдущих знаний требуется и избегает суровых химических и температурных условий, таких как бисульфит лечения или инкубации с 5-azaC. Секвенирование MeRIP и бисульфита может быть ингибировано вторичными структурамиРНК 36. Этап фрагментации, включенный в анализ MeRIP до иммунопреципиентации, направлен на облегчение связывания антител и увеличение разрешенияидентификации m 5C.

Другим методом, который стоит упомянуть, является масс-спектрометрия (МС) нуклеозидов РНК. MS может обнаруживать и различать любой тип модификации как на ДНК, так и на РНК. Кратко, РНК извлекается и DNase усваивается, затем desalted и переваривается до одного нуклеозида. Ядра РНК анализируются масс-спектрометром. Этот метод может быть использован для количественной оценки уровней каждой модификации, и он не полагается на антитела или химической конверсии. Однако основным недостатком является то, что она предоставляет объемную информацию о наличии модификаций РНК. Для того, чтобы сопоставить изменения, MS необходимо сочетать с RNase пищеварения и секвенирования информации о конкретных молекул РНК, как и в случае человека tRNALeu(CAA)37.

Здесь мы описываем и обсуждаем анализ MeRIP, используемый для изученияметилирования РНК m 5C в Arabidopsis17.

Protocol

1. Подготовка РНК Измельчить 200 мг растительной ткани, чтобы порошок в жидком азоте, убедившись, что ткань остается замороженным на протяжении всей процедуры. Извлекайте РНК из желаемой растительной ткани после протокола извлечения кислотного гуанидина тиоцианата-фенола-хлороформа. Чтобы уменьшить возможность загрязнения РНК ДНК во время фазового отделения, используйте 1-бромо-3-хлоропропан вместо хлороформа. Добавьте 1 мл реагента экстракции РНК, содержащего гуанидин тиоцианат и кислотный фенол, в измельченную растительную ткань (500 л на 100 мг ткани). Хорошо перемешать путем инвертирования и убедитесь, что все ткани мокрые. Инкубационный в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы разобщить рибонуклеопротеин комплексов. Центрифуга в течение 10 мин при 12 000 х г при 4 градусах Цельсия и передача супернатанта в новую трубку 1,5 мл. Добавьте 200 йл 1-бромо-3-хлоропропана (100 мкл на 500 МКЛ реагента извлечения РНК) и вихрь энергично. Центрифуга в течение 15 мин при 12 000 х г при 4 градусах Цельсия и перенос верхней aqueous фазы (приблизительно 500 МЛ) в новую трубку 1,5 мл. Добавьте 1 том изопропанола (500 мкл) и 0,1 тома 3 М ацетата натрия рН 5,5 (50 мкл), хорошо перемешайте и выпайте 10 мин при -20 градусах Цельсия.ПРИМЕЧАНИЕ: Использование ацетата натрия (NaOAc) рекомендуется для того, чтобы увеличить РНК осадков. Протокол может быть приостановлен в этот момент, продлевая осадки РНК на несколько часов или даже на ночь. Центрифуга в течение 30 мин при 12000 х г при 4 градусов по Цельсию и отбросить супернатант. Вымойте гранулы дважды с 500 МКЛ 80% EtOH, центрифуга в течение 5 мин при 12000 х г при 4 кк и выбросить. Вымойте гранулы один раз с 500 йл 99% EtOH, центрифуга в течение 5 мин при 12000 х г при 4 градусов по Цельсию и выбросить. Высушите гранулы на 5-10 мин и растворите в 30 МКЛ без RNase H2O.ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо этого используйте любой протокол извлечения РНК по выбору (например, систему на основе столбца). Если пищеварение DNase включено в протокол, пропустите его следующим шагом (шаг 1.3). Измерьте концентрацию РНК (например, с помощью спектрофотометра) и переварите 20 мкг РНК с DNase.ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК богатам 5С и антитела не различают ДНК и РНК. В типичной реакции DNase, лечить 10 мкг РНК в 50 йл реакции. Смешайте следующие компоненты и инкубировать реакцию (ы) при 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин:10 мкг РНК х йл10x DNase буфер 5 йлDNase 1 хл (2 единицы)Без RNase H2O до 50 МКЛ Удалите фермент либо путем добавления соответствующего объема реагента инактивации DNase (если он включен в комплект DNase и в соответствии с инструкциями производителя), либо выполняя шаг очистки (например, очистка колонки или извлечения фенола/хлороформа). Проверьте качество и чистоту изолированной РНК капиллярным электрофорезом и продолжайте, если число целостности РНК (RIN) выше 7, чтобы убедиться, что образцы хорошего качества. OPTIONAL: Удалите рибосомную РНК, чтобы обогатить образцы в содержании мРНК с помощью комплекта удаления rRNA и в соответствии с протоколом производителя. Используйте DNase обработанные РНК от предыдущего шага для реакции истощения rRNA (ы). Выполните несколько реакций, если количество общей РНК больше, чем максимальная сумма, предложенная для реакции. Обратите внимание, что только 5-10% от суммы ввода будут восстановлены после истощения rRNA. Продолжить с рРНК обедненной РНК (равное количество для всех образцов) и игнорировать суммы, упомянутые в следующих шагах, поскольку они относятся к общей РНК.ПРИМЕЧАНИЕ: Для сравнения и описания доступных методов истощения rRNA см. ссылки 38,39,40. рРНК является основной частью общей РНК и м 5 Сметилируетсяво многих организмах. Подготовьтесь заранее в пробирке стенограммы (IVT), которые будут использоваться в качестве контроля РНК последовательностей и добавить их в образцах. Производить два различных IVTs с использованием комплекта транскрипции in vitro, один с не метилированными нуклеозидами и один, где rCTP заменяется 5-метил-rCTP, чтобы служить отрицательным и положительным контролем в MeRIP, соответственно. Стенограммы были подготовлены те из EGFP и Ренилла luciferase.ПРИМЕЧАНИЕ: IVTs не должно существовать в транскриптоме организма вы анализируете. Если IVTs взяты из одного шаблона (например, оба EGFP), то добавьте положительный и отрицательный контроль в двух разных образцах. Если их последовательность отличается (например, EGFP и Renilla), они могут быть добавлены в один и тот же образец. Спайк в каждой выборке 0,1 нг IVT на 3 мкг РНК, как элементы управления. Sonicate РНК примерно до 100 nt фрагментов.ПРИМЕЧАНИЕ: Условия рнк стрижки должны быть скорректированы заранее, и они отличаются для каждого sonicator. Для модели, используемой здесь, sonication выполняется со следующими условиями: Пик мощности 174, Коэффициент долга 10, Циклы / взрыв 200, 17 мин. Sonicate одинаковое количество РНК для всех образцов, по крайней мере 12 мкг РНК на образец в 80 МКЛ от общего объема (мин 60 МКЛ, максимум 100 МКЛ), наполненный RNase-бесплатно H2O. Подтвердите эффективность звуковой и концентрации образцов РНК с помощью капиллярного электрофореза. Средний размер фрагментированной РНК должен быть около 100 nt. 2. Метилированная РНК Иммунопреципиентация (MeRIP) В низкопереплетающие трубки добавьте 9 мкг звуковой РНК и без RNase H2O до 60 МКЛ (или более, в зависимости от концентрации). Отмежеваться от вторичных структур, нагревая РНК при 70 градусов по Цельсию в водяной бане в течение 10 минут и охлаждения в течение еще 10 минут в ледяной смеси. Разделите образец на три части: одна треть (20 МКЛ, если 60 МКЛ были взяты в шаге 2.1) сохраняется в отдельной трубке при -80 градусов по Цельсию в качестве входного образца. Заполните оставшиеся 40 МКЛ без RNase H2O до 860 МКЛ, а затем разделите на две низкосвязные трубки: одну для IP и одну для управления Mock (430 КЛ каждая). Добавьте к обеим трубкам:50 МКЛ 10x буфера MeRIP10 МКЛ ингибитора RNase10 МКЛα-м 5С антитела (10 мкг) в образце ИС на 10 МЛ H2O в образце МокПРИМЕЧАНИЕ: Клон антител, используемый ранее, больше не доступен в коммерческих системах. Тем не менее, любые анти-5-метилцитозин моноклональные антитела должны работать аналогичным образом. Антитела должны быть проверены на специфичность перед использованием для MeRIP11,23. Печать труб с парафильмом и инкубировать в течение 12-14 часов при 4 градусов по Цельсию, с накладным вращением. На следующий день приготовьте белок G магнитных бусин для связывания. Для каждой трубки (либо IP или Mock управления), используйте 40 йл бисера. Добавьте общее количество бисера (я) трубок x 40 йл, например, для 2 образцов IP и 2 Mock требуется 160 МКЛ бусинок) в трубке 15 мл и мыть три раза с 800 йл буфера 1x MeRIP на образец (я трубки х 800 йл буфера, например, 3,2 мл для 2 IP и 2 Мок образцов). Выполните мойки при комнатной температуре в течение 5 минут с накладным вращением, соберите бисер с помощью магнитной стойки и отбросьте буфер стирки. После третьей стирки, повторное использование бисера в том же объеме 1x MeRIP буфера, как первоначальный объем бисера принято (я труб х 40 йл, например, 160 йл 1x MeRIP буфера для 2 IP и 2 Мок образцов).ПРИМЕЧАНИЕ: Количество используемого белка G шариков определяется связывающей способностью бисера для конкретного типа антител и количеством используемых антител. В этом случае бисер имеет связывающую емкость около 8 мкг мыши IgG на мг бисера и 30 мг/мл концентрации. Таким образом, 40 МКЛ достаточно, чтобы связать приблизительно 9,6 мкг антител. Добавьте 40 йл повторно натяжиреных бусин к каждому образцу IP и Mock и инкубировать в течение дополнительных 2 часов при 4 градусах Цельсия, с накладным вращением. Поместите трубки на магнитную стойку в течение 1 мин и отбросьте супернатант или сохраните его в качестве контроля (не связанный образец РНК). Вымойте бисер 5 раз путем повторного перерасхода в 700 йл 1x MeRIP буфер поставляется с 0,01% Tween 20 и инкубации в течение 10 мин при комнатной температуре с накладным вращением. Resuspend вымытые бусы в 200 йл протеиназы K реактора буфера и добавить 3,5 МКЛ протеиназы K. Incubate в течение 3 часов при 50 градусов по Цельсию, встряхивая при 800 об /мин. Иногда, Флик вручную нижней части трубки, если осадок бисера формируется во время инкубации. Извлекайте РНК путем добавления 800 МКЛ реагента экстракции РНК и следуя протоколу извлечения кислотного гуанидина тиоцианата-фенола-хлороформа, и продолжайте, как в шаге 1.2. Для повышения видимости гранул РНК в изопропанол на этапе осадков можно добавить цветной со-обрывок. Переусердуйте гранулы в 20 МКЛ без RNase H2O (или равна объему ввода, сохраненного в шаге 2.3). 3. Анализ вниз по течению Отправить образцы ввода и ИС для одного конца последовательности с 50 баз длины чтения (SE50). Обрезать 3′ энд адаптеры с использованием cutadapt41 и отказаться читает, которые короче, чем 48 nt. Карта обрезается читает геном Arabidopsis (TAIR10 аннотация) с использованием STAR42 с вырезом 6% для несоответствий и максимальный размер интрона 10 кб. Храните уникально отображенные считывает для дальнейшего анализа. Определите обогащенные фрагменты РНК в образцах ИС по сравнению с Input с помощью двух различных методов и рассмотрим те, которые значительно обогащены обоими. Во-первых, обнаружить пики MeRIP-seq с помощью MACS2 пикабонента 43 на объединились IPs против ввода. Во-вторых, следуйте анализу пика MeRIP-seq, как описано в Meyer et al.22 и Yang et al.17. Используя пользовательские скрипты R, разделите геном на различные окна 25 nt и подсчитайте количество уникально отображенных считых считых данных для каждого окна в зависимости от положения последнего картографного нуклеотида (так как считывки происходят из фрагментов РНК 100 nt). Рассчитайте значительно обогащенные окна в образцах IP по сравнению с Input с Fisher Exact Test. Используйте процедуру Бенджамини-Хохберга для коррекции для многократного тестирования. Держите значительно обогащенные пики, которые охватывают по крайней мере два последовательных окна и отказаться пики, которые охватывают только одно окно. Определите аннотированные области генома (транскрипты) со значительно обогащенными пиками, найденными обоими методами. В качестве альтернативы или дополнительно, проверить конкретные цели РНК для их обогащения в образцах ИС. Обратный транскрибировать РНК (тот же объем входных, IP и Mock образцов) со случайными hexamers. Выполняйте количественные ПЦР в режиме реального времени по выбранным целям, сравнивая Input, IP и Mock с помощью метода «CT».ПРИМЕЧАНИЕ: Генерируемый продукт не должен быть длиннее 100 б.п., так как это средний размер фрагментации.

Representative Results

Схема метода представлена на рисунке 1. Первыми важными шагами протокола являются получение РНК хорошего качества (RIN ≥ 7) и sonicate его примерно до 100 nt фрагментов. Эффективность обоих ступеней изучается чип-капиллярной электрофорезной машиной. На рисунке 2Aпоказан репрезентативный пробег хорошего образца РНК. Образец разбавляется 1:10 перед погрузкой на чип, чтобы иметь концентрацию, которая находится в диапазоне обнаружения используемого комплекта (5-500 нг/йл). Тот же образец также работает после sonication и показано на рисунке 2B. Обратите внимание на наличие одного равномерного пика, сдвинутого влево от диаграммы, размером около 100 нуклеотидов. Более низкая концентрация вызвана как потерей РНК во время фрагментации, так и увеличением объема проб (60-100 МКЛ, шаг 1.7.1). Качество образцов IP и Mock можно оценить с помощью qRT-PCR. С этой целью шипованные IVT служат положительным и отрицательным контролем: метилированный IVT, где во всех положениях цитозинаесть m 5C, как ожидается, будет сильно обогащен в образце ИС; напротив, не метилированный ИВТ не должен иметь разницы между ИС и Моком. Праймеры, используемые в анализе qRT-PCR для двух контрольных IVTs(EGFP и Renilla luciferase), перечислены в таблице 1. Действительно, как показано на рисунке 3, около 80% метилированного IVT было восстановлено в образце IP, и только около 2% в Mock. Для не метилированного контроля восстановление было ниже 1% как в пробах ИС, так и в Mock. Это проверяет эффективность MeRIP, что метилированные фрагменты РНК были осаждены и обогащены, и является хорошим показателем того, что образцы могут быть использованы для анализа вниз по течению. Кроме того, в качестве порога для оценки значимости обогащения в анализах кРТ-ПЦР можно использовать складное обогащение не метилированного ИВТ (отношение ИС к Моку). После выравнивания считывания с геномом(рисунок 4),алгоритмы пикового вызова, описанные в шагах 3.4.1 и 3.4.2, применяются для определения статистически значимых окон, обогащенных в образцах IP по сравнению с Input. Последовательности, соответствующие этим окнам, можно использовать далее, например, для поиска сохраненных мотивов, связанныхс метилированием 11,17. Рисунок 1: Схематическое представление протокола MeRIP-seq.Образцы РНК инкубированы антителом к 5-метилированным цитосинам, а комплексы стягиваются с помощью белка G магнитных бусин, которые захватывают антитела вместе с связанной РНК. Образцы еленной РНК анализируются путем глубокого секвенирования и qRT-PCR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Репрезентативные результаты качественного анализа образцов РНК.(A)Представитель профиля квалифицированного общего образца завода РНК. (B)Репрезентативный профиль образца РНК после звукового данных до 100 nt фрагментов. Вывод файлов из капиллярного программного обеспечения электрофореза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: qRT-PCR анализ контроля IVTs.Метилированные и не метилированные транскрипты in vitro использовались в качестве положительного и отрицательного контроля анализа MeRIP, соответственно. После иммунопреципиентации метилированный IVT сильно обогащается в образце ИС (зеленый), но не в образце Mock (без антител противм 5С; фиолетовый). Не метилированный IVT не показал обогащения и никакой разницы между ИС и Мок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: Прочитайте выравнивание до и после MeRIP вокруг репрезентативной стенограммы.Читается в соответствии с конкретной стенограммой в образце Input (верхний ряд) и в двух IP-репликациях (средний и нижний ряд). Черный ящик показывает идентифицированное обогащенное окно длиной 50 nt на основе анализов MACS243 и MeRIP-seq22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Целевой Праймер пара Последовательность продуктов Длина продукта EGFP Для: 5′- GGCAACTACAAGACCCGCC -3′ GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGACACCCTGГТГААКЧГККАТГАГКТГААГГГК 72 б.п. Преподобный: 5′- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3′ Ренилла Люцифераза Для: 5′- GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAAC -3′ GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACCATGTTGCCATCAAAAATCATGAGAAАГТТАГААККАГАААТТГКАГК 75 б.п. Преподобный: 5′- GCTGCAAATTCCTCTGGCTCTAA -3′ Таблица 1: Информация о праймерах и генерируемых продуктах для анализа qRT-PCR. Рецепты буфера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

РНК несет в себе более ста различных базовых модификаций4, которые образуют эпитранскриптом44. Эти изменения добавляют дополнительный уровень регулирования перевода и сигнализации(рассмотрено в 5,6,8,20,45,46). Ранние исследования были в состоянии обнаружить наличие пост-транскрипционных модификаций наРНК 28,47, но конкретные модифицированные РНК должны быть определены для того, чтобы понять роль эпитранскриптомики. MeRIP был разработан как метод для карты РНК метилирования сайтов транскриптомавсей 21,22. Он может быть адаптирован к любой модификации, если имеется определенное антитело.

Основная сила этого протокола является то, что является относительно простым, безопасным для РНК и пользователя (например, 5-azaC является высокотоксичным для растений и людей) и не требует последовательности или изменения информации фермента. Кроме того, обогащение метилированных РНК ИС повышает вероятность обнаружения низких обильных мРНК, в отличие от секвенирования бисульфита, который не содержит шага обогащения. При двух серийных раундах MeRIP обогащение фрагментов РНК, содержащих метилирование, увеличивается ещена 22. Одним из ограничений MeRIP, особенно при применении к исследованиям метилирования мРНК, является большое количество РНК, необходимых в качестве ввода для анализа. Рибоделирование – или поли (A) обогащение – шаг уменьшит фон, вызванный сильно измененной рибосомной РНК, но он удаляет более 90% от общего количества РНК. ДНК также должна быть полностью удалена, поскольку она богата 5-метилированными цитоцинами. Другим недостатком является более низкое разрешение точного положения метилирования. Sonication РНК до инкубации с антителом помогает в этом направлении путем сужения области, содержащей модификацию до 100-200 нуклеотидов. Когда MeRIP сочетается с глубоким секвенированием, разрешениепрогноза участка m 5C увеличивается по мере того, как секвенирование читает форму гауссийского распределения вокруг потенциального места метилирования. Кроме того, специфика антитела должна быть подтверждена до анализа (например, с РНК точка пятно анализы, выполненные с олиго синтезированы с модифицированными нуклеотидами), однако, в какой степени антитела могут реально различать тесно связанные изменения (например, м6А им 6утра) является точкой аргумента вполе 48,49. Кроме того, высоко структурированные РНК могут вмешиваться во взаимодействие антител и антигенов, что является еще одним ограничением, которое в основном решается с фрагментацией и денатурацией РНК до ИС. Напротив, секвенирование бисульфита, которое также зависит от вторичных структур, не включает в себя шаг фрагментации, и это может быть одной из причин, что вызывает расхождениемежду m 5C сайтов и mRNAs предсказал бисульфитсеквенирования 16 и MeRIP-seq11,17. Другие модификации цитозина (например, hm5C) также устойчивы к бисульфит-опосредованного деаминации35.

Модификации MeRIP-seq включают в себя перекрестный шаг, либо с введением фотоактивируемого рибонуклеозида (фото-перекрестногом 6A-seq, PA-m6A-seq 50)или с использованием УФ-излучения для создания перекрестных ссылок антител-РНК после IP (miCLIP49, другой метод, чем miCLIPописано во введении 30, но и с индивидуальным нуклеотидным разрешением). В будущем, по мере накопления знаний о метилировании РНК, предпочтительнее могут быть более целенаправленные подходы, основанные на изменяющихся ферментах и/или консенсусных последовательностях, в которых появляется метилирование. Идентификация белков считывания имеет важное значение для понимания молекулярной и сигнальной функции постткриптуционных модификаций. Технология секвенирования nanopore уже позволяет прямой идентификации модифицированных нуклеотидов без предварительного леченияРНК 17, но есть еще возможности для совершенствования в этой области в отношении глубины последовательности и биоинформатического анализа. В целом, MeRIP-seq в настоящее время является установленным, надежным и беспристрастным подходом к выявлению метилированных РНК стенограмм.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана стипендией IMPRS PhD для E.S., долгосрочным стипендием EMBO V.P., и внутренними фондами MPI-MPP для F.K. Часть этой работы также финансировалась через PLAMORF, проект, который получил финансирование от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках исследовательской и инновационной программы Европейского союза Horizon 2020 (Соглашение о гранте No 81013). Авторы хотели бы поблагодарить Федерико Апельта за биоинформатический анализ и комментарии к рукописи, а Матье Бахина и Амиру Крамди – за биоинформатическое анализ.

Materials

α‐m5C antibody ZymoResearch A3001 (discontinued), A3002 available Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available
Chip and reagents for capillary electrophoresis Agilent 5067-1511 RNA 6000 Nano kit
Dnase Ambion AM1907 TURBO DNA-free kit
Co-precipitant of nucleic acids Ambion AM9515 Glycoblue, 15 mg/mL
In vitro transcription kit Promega P1300 T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System
Low-binding reaction tubes Kisker Biotech G017 1.7 ml microcentrifuge tubes
Protein G magnetic beads Invitrogen 10003D Dynabeads Protein G
Proteinase K Ambion AM2546 20mg/mL stock solution, RNA grade
RNase inhibitor Promega N2615 RNasin Plus 40 U/μl
rRNA removal kit Epicentre RZPL11016 Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)
Sonication tubes Covaris 520045 microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm
RNA extraction reagent Ambion 15596018 TRIzol reagent
Equipment
Capillary electrophoresis machine Agilent G2939BA 2100 Bioanalyzer System
Magnetic rack Invitrogen 12321D DynaMag-2
Microentrifuge Eppendorf discontinued 5417R model
Rotator Benchmark R4040 RotoBot Mini
Sonicator Covaris 500217 S220 Focused-ultrasonicator
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONEC-W NanoDrop OneC
Waterbath GFL 1012 1012 Incubation bath
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trixl, L., Lusser, A. The dynamic RNA modification 5-methylcytosine and its emerging role as an epitranscriptomic mark. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), 1-17 (2019).
  2. Mongan, N. P., Emes, R. D., Archer, N. Detection and analysis of RNA methylation. F1000Research. 8, 559 (2019).
  3. Cantara, W. A., et al. The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update. Nucleic Acids Research. 39, 195-201 (2011).
  4. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (1), 303-307 (2018).
  5. Agris, P. F. Bringing order to translation: the contributions of transfer RNA anticodon-domain modifications. EMBO reports. 9 (7), 629-635 (2008).
  6. Chow, C. S., Lamichhane, T. N., Mahto, S. K. Expanding the Nucleotide Repertoire of the Ribosome with Post-Transcriptional Modifications. ACS Chemical Biology. 2 (9), 610-619 (2007).
  7. Gigova, A., Duggimpudi, S., Pollex, T., Schaefer, M., Koš, M. A cluster of methylations in the domain IV of 25S rRNA is required for ribosome stability. RNA. 20 (10), 1632-1644 (2014).
  8. Motorin, Y., Helm, M. tRNA Stabilization by Modified Nucleotides. Biochemistry. 49 (24), 4934-4944 (2010).
  9. Shatkin, A. Capping of eucaryotic mRNAs. Cell. 9 (4), 645-653 (1976).
  10. Shen, L., et al. N 6 -Methyladenosine RNA Modification Regulates Shoot Stem Cell Fate in Arabidopsis. Developmental Cell. 38 (2), 186-200 (2016).
  11. Cui, X., et al. 5-Methylcytosine RNA Methylation in Arabidopsis Thaliana. Molecular Plant. 10 (11), 1387-1399 (2017).
  12. Huber, S. M., et al. Formation and abundance of 5-hydroxymethylcytosine in RNA. ChemBioChem. 16 (5), 752-755 (2015).
  13. Zuber, H., et al. Uridylation and PABP Cooperate to Repair mRNA Deadenylated Ends in Arabidopsis. Cell Reports. 14 (11), 2707-2717 (2016).
  14. Luo, G. Z., et al. Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana. Nature Communications. 5 (1), 5630 (2014).
  15. Wan, Y., et al. Transcriptome-wide high-throughput deep m6A-seq reveals unique differential m6A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana. Genome Biology. 16 (1), 1-26 (2015).
  16. David, R., et al. Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs. The Plant Cell. 29 (3), 445-460 (2017).
  17. Yang, L., et al. m5C Methylation Guides Systemic Transport of Messenger RNA over Graft Junctions in Plants. Current Biology. 29 (15), 2465-2476 (2019).
  18. Sun, L., et al. Transcriptome-wide analysis of pseudouridylation of mRNA and non-coding RNAs in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 70 (19), 5089 (2019).
  19. Chmielowska-Bąk, J., Arasimowicz-Jelonek, M., Deckert, J. In search of the mRNA modification landscape in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 421 (2019).
  20. Liang, Z., Riaz, A., Chachar, S., Ding, Y., Du, H., Gu, X. Epigenetic Modifications of mRNA and DNA in Plants. Molecular Plant. 13 (1), 14-30 (2020).
  21. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  22. Meyer, K. D., et al. Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3′ UTRs and near Stop Codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  23. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m5C within archaeal mRNAs. PLoS genetics. 9 (6), 1003602 (2013).
  24. Dominissini, D., et al. The dynamic N1-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
  25. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N1-methyladenosine methylome. Nature Chemical Biology. 12 (5), 311-316 (2016).
  26. Hotchkiss, R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. Journal of Biological Chemistry. 175 (175), 315-332 (1948).
  27. Wyatt, G. R. Occurence of 5-Methyl-Cytosine in Nucleic Acids. Nature. 166, 237-238 (1950).
  28. Dubin, D. T., Taylor, R. H. The methylation state of poly A-containing- messenger RNA from cultured hamster cells. Nucleic Acids Research. 2 (10), 1653-1668 (1975).
  29. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1-16 (2017).
  30. Hussain, S., et al. NSun2-mediated cytosine-5 methylation of vault noncoding RNA determines its processing into regulatory small RNAs. Cell Reports. 4 (2), 255-261 (2013).
  31. Khoddami, V., Cairns, B. R. Identification of direct targets and modified bases of RNA cytosine methyltransferases. Nature biotechnology. 31 (5), 458-464 (2013).
  32. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  33. Yang, X., et al. 5-methylcytosine promotes mRNA export – NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27 (5), 606-625 (2017).
  34. Burgess, A., David, R., Searle, I. R. Conservation of tRNA and rRNA 5-methylcytosine in the kingdom Plantae. BMC Plant Biology. 15 (1), 199 (2015).
  35. Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing. Nucleic Acids Research. 37 (2), (2009).
  36. Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nature Genetics. 37 (8), 853-862 (2005).
  37. Auxilien, S., Guérineau, V., Szweykowska-Kulińska, Z., Golinelli-Pimpaneau, B. The human tRNA m (5) C methyltransferase Misu is multisite-specific. RNA Biology. 9 (5), 1331-1338 (2012).
  38. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
  39. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterial biofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7 (1), 41114 (2017).
  40. Huang, Y., Sheth, R. U., Kaufman, A., Wang, H. H. Scalable and cost-effective ribonuclease-based rRNA depletion for transcriptomics. Nucleic Acids Research. 48 (4), 20 (2020).
  41. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  42. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  43. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), 137 (2008).
  44. Saletore, Y., et al. The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications. Genome Biology. 13 (10), 175 (2012).
  45. Schwartz, S. Cracking the epitranscriptome. RNA. 22 (2), 169-174 (2016).
  46. Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2016).
  47. Keith, G. Mobilities of modified ribonucleotides on two-dimensional cellulose thin-layer chromatography. Biochimie. 77 (1-2), 142-144 (1995).
  48. Feederle, R., Schepers, A. Antibodies specific for nucleic acid modifications. RNA Biology. 14 (9), 1089-1098 (2017).
  49. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  50. Chen, K., et al. High-Resolution N 6 -Methyladenosine (m 6 A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m 6 A Sequencing. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).

Tags

Methylated RNA ImmunoprecipitationMeRIPRNA ModificationTranscriptomeArabidopsisRNA ExtractionGuanidine ThiocyanateAcid Phenol1-bromo-3-chloropropaneIsopropanolSodium AcetateEthanolDNaseRNA Integrity NumberIn Vitro TranscriptSonication

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (159), e61231, doi:10.3791/61231 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image