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Ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado para estudar m5C modificação em Arabidopsis

Published: May 14, 2020
doi:
10.3791/61231
, , ,
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, 2Department of Molecular Medicine, Medical School,University of Padua, 3Biologie de l’Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France

Summary

O ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado é um método à base de anticorpos usado para enriquecer para fragmentos de RNA metilado. Juntamente com sequenciamento profundo, leva à identificação de transcrições carregando a modificação m5C.

Abstract

Modificações de base secundárias no RNA, como o m5C, afetam a estrutura e a função das moléculas modificadas de RNA. Imunoprecipitação e sequenciamento de RNA metilado (MeRIP-seq) é um método que visa enriquecer para RNA metilado e, finalmente, identificar transcrições modificadas. Brevemente, o RNA sonicado é incubado com um anticorpo para citosinas de 5 metilados e precipitado com a ajuda de contas G proteicas. Os fragmentos enriquecidos são então sequenciados e os potenciais locais de metilação são mapeados com base na distribuição das leituras e detecção de pico. O MeRIP pode ser aplicado a qualquer organismo, pois não requer nenhuma sequência prévia ou modificação do conhecimento enzimante. Além da fragmentação, o RNA não está sujeito a nenhum outro tratamento químico ou de temperatura. No entanto, o MeRIP-seq não fornece previsão de nucleotídeo único do local de metilação como outros métodos fazem, embora a área metilada possa ser reduzida a alguns nucleotídeos. O uso de diferentes anticorpos específicos de modificação permite que o MeRIP seja ajustado para as diferentes modificações de base presentes no RNA, ampliando as possíveis aplicações deste método.

Introduction

Em todos os três reinos da vida, as espécies de RNA sofrem modificações pós-transcricionais e pesquisas sobre essas modificações bioquímicas funcionalmente relevantes são chamadas de “epitranscriptomia”. Epitranscriptomia é um campo em crescimento e vários métodos estão sendo desenvolvidos para estudar e mapear as modificações nas moléculas de RNA (revisadas em1,2). Mais de cem modificações de RNA foram encontradas, detectadas em rRNAs, tRNAs, outros ncRNAs, bem como mRNAs3,4. Embora a presença e a função de modificações pós-transcricionais quimicamente diversas em tRNAs e rRNAs sejam extensivamente estudadas5,6,7,8, apenas recentemente foram caracterizadas modificações de mRNA. Nas plantas, muitas modificações de mRNA foram identificadas até o momento, incluindo m7G na estrutura da tampa9, m1A10, hm5C11,12, e uridylation13. No entanto, apenas m6A10,14,15, m5C11,16,17, e pseudouridina18 foram mapeados em arabidopsis. Modificações de base mRNA pós-transcrição estão envolvidas em vários processos de desenvolvimento19,20.

Uma das abordagens mais utilizadas na epitranscriptomia é a imunoprecipitação de RNA metilada aliada ao sequenciamento profundo (MeRIP-seq). O MeRIP-seq foi desenvolvido em 2012 para estudar m6A em células de mamíferos21,22. Requer o uso de um anticorpo para a modificação desejada e visa enriquecer para fragmentos de RNA que carregam o nucleotídeo modificado.s. Geralmente é seguido por sequenciamento profundo para identificar e mapear os fragmentos enriquecidos ou PCR quantitativo para verificar alvos específicos de RNA. A precisão do MeRIP baseia-se na especificidade do anticorpo para reconhecer o nucleotídeo modificado sobre modificações semelhantes (por exemplo, m5C e hm5C11,23). Além do m6A, o MeRIP-seq também foi aplicado para estudar m1A e m5C RNA metilação em diversos organismos11,17,23,24,25.

A metilação da citosina na quinta posição de carbono (m5C) é a modificação de DNA mais prevalente26,27 e uma das modificações mais comuns do RNA também3,4. Enquanto o m5C foi detectado em mRNAs eucarióticos em 197528, só recentemente tem estudos focados no mapeamento da modificação transcriptome-wide, em codificação e não codificação RNAs11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.

Métodos alternativos utilizados na pesquisa m5C RNA incluem conversão química de citosinas não metiladas em uracils (sequenciamento de bisulfo) e ensaios de imunoprecipitação baseados em uma ligação irreversível de um conhecido RNA citosina metiltransferase aos seus alvos de RNA (miCLIP, aza-IP). Em breve, o sequenciamento de bisulfato explora a característica de citosina 5-metilada para ser resistente ao tratamento de bisulfito de sódio que desamina cistilha cistão para uracil. O método foi desenvolvido pela primeira vez para o DNA, mas adaptado para RNA também e muitos estudos optaram por essa abordagem para detectar m5C em RNA16,23,29,32,34,35. Tanto o miCLIP quanto o aza-IP exigem conhecimento prévio da metiltransferase de citosina RNA e uso do respectivo anticorpo. No caso do miCLIP (metilação individual-nucleotídeo-resolução crosslinking e imunoprecipitação), o metiltransferase carrega uma única mutação de aminoácidos de modo que se liga ao substrato de RNA, mas não pode ser liberado30. Em aza-IP (imunoprecipitação de RNA mediada 5-azacytidine), a ligação irreversível é formada entre o nucleosídeo 5-azac e o RNA citosina metiltransferase quando exogenou 5-azaC é incorporada por polimerases de RNA em uma molécula de RNAalvo 31.

A principal vantagem desses três métodos é que eles permitem o mapeamento da resolução de nucleotídeos únicos de m5C. Além disso, o miCLIP e o aza-IP fornecem informações sobre os alvos específicos de um metiltransferase de citosina RNA selecionada, decifrando mais profundamente o mecanismo e o papel das modificações pós-transcrição do RNA. No entanto, a abordagem MeRIP-seq pode identificar regiões transcriptome-wide m5C sem qualquer conhecimento prévio necessário e evita condições químicas e de temperatura severas, como tratamento de bisulfato ou incubação com 5-azaC. Tanto o sequenciamento de MeRIP quanto o bisullfita podem ser inibidos pelas estruturas secundárias de RNA36. A etapa de fragmentação incluída no ensaio merip antes da imunoprecipitação visa facilitar a ligação de anticorpos e aumentar a resolução da identificação m5C.

Outro método que vale a pena mencionar é a espectrometria de massa (MS) dos nucleosídeos de RNA. A ESM pode detectar e distinguir qualquer tipo de modificação tanto no DNA quanto no RNA. Resumidamente, o RNA é extraído e dNase digerido, depois desalado e digerido para nucleosídeos únicos. Os nucleosídeos de RNA são analisados por um espectrômetro de massa. Este método pode ser usado para quantificar os níveis de cada modificação e não depende de um anticorpo ou de uma conversão química. No entanto, uma grande desvantagem é que ele fornece informações em massa sobre a presença de modificações de RNA. Para mapear as modificações, a EM precisa ser combinada com informações de digestão e sequenciamento de RNase sobre moléculas específicas de RNA, como no caso do tRNALeuhumano(CAA)37.

Aqui, descrevemos e discutimos o ensaio MeRIP usado para estudar a metilação m5C RNA em Arabidopsis17.

Protocol

1. Preparando o RNA Triture 200 mg de tecido vegetal em pó em nitrogênio líquido, certificando-se de que o tecido permaneça congelado durante todo o procedimento. Extrair o RNA do tecido vegetal desejado seguindo um protocolo de extração de tiocianato-cloronato ácido guanidinium-phenol-clorofórmio. Para diminuir a possibilidade de contaminar o RNA com DNA durante a separação de fase, use 1-bromo-3-cloropropano em vez de clorofórmio. Adicione 1 mL de reagente de extração de RNA contendo tiocianato de guanidina e fenol ácido ao tecido vegetal moído (500 μL por tecido de 100 mgs). Misture bem invertendo e certifique-se de que todo o tecido está molhado. Incubar por 10 minutos à temperatura ambiente para dissociar os complexos ribonucleoproteínos. Centrifugar por 10 min a 12.000 x g a 4 °C e transferir o supernasal para um novo tubo de 1,5 mL. Adicione 200 μL de 1-bromo-3-cloropropano (100 μL por 500 μL reagente de extração de RNA) e vórtice vigorosamente. Centrifugar por 15 min a 12.000 x g a 4 °C e transferir a fase aquosa superior (aproximadamente 500 μL) para um novo tubo de 1,5 mL. Adicione 1 volume de isopropanol (500 μL) e 0,1 volume de acetato de sódio de 3 M pH 5,5 (50 μL), misture bem invertendo e precipitando 10 min a -20 °C.NOTA: Recomenda-se o uso de acetato de sódio (NaOAc) para aumentar a precipitação do RNA. O protocolo pode ser pausado neste momento prolongando a precipitação do RNA por algumas horas ou até mesmo durante a noite. Centrifugar por 30 min a 12.000 x g a 4 °C e descartar o supernaspe. Lave a pelota duas vezes com 500 μL de 80% EtOH, centrífuga por 5 min a 12.000 x g a 4 °C e descarte. Lave a pelota uma vez com 500 μL 99% EtOH, centrífuga por 5 min a 12.000 x g a 4 °C e descarte. Seque a pelota por 5-10 min e dissolva em 30 μL de H2O sem RNase.NOTA: Em vez disso, use qualquer protocolo de extração de RNA de escolha (por exemplo, um sistema baseado em colunas). Se uma digestão DNase estiver incluída no protocolo, pule-a na etapa seguinte (etapa 1.3). Meça a concentração de RNA (por exemplo, com o uso de um espectrofotômetro) e digerir 20 μg de RNA com DNase.NOTA: O DNA é rico em m5C e o anticorpo não distingue entre DNA e RNA. Em uma reação típica de DNase, trate 10 μg de RNA em uma reação de 50 μL. Misture os seguintes componentes e incubar a reação a 37 °C por 30 min:10 μg de RNA x μL10x Buffer DNase 5 μLDNase 1 μL (2 unidades)H2O sem rnase até 50 μL Remova a enzima adicionando um volume apropriado de reagente de inativação DNase (se estiver incluído no kit DNase e de acordo com as instruções do fabricante) ou realizando uma etapa de limpeza (por exemplo, purificação da coluna ou extração de fenol/clorofórmio). Verifique a qualidade e pureza do RNA isolado por eletroforese capilar e proceda se o número de integridade do RNA (RIN) for superior a 7, para garantir que as amostras sejam de boa qualidade. OPCIONAL: Remova o RNA ribossômico para enriquecer as amostras em conteúdo mRNA usando um kit de remoção de rRNA e de acordo com o protocolo do fabricante. Use o RNA tratado de DNase da etapa anterior para a reação de esgotamento do rRNA( s). Realize múltiplas reações se a quantidade de RNA total for superior à quantidade máxima sugerida para a reação. Observe que apenas 5-10% do valor de entrada será recuperado após o esgotamento do rRNA. Proceda com o RNA esgotado rRNA (quantidade igual para todas as amostras) e ignore os valores mencionados nas etapas seguintes, como se referem ao RNA total.NOTA: Para comparação e descrição dos métodos de esgotamento do rRNA disponíveis, consulte as referências 38,39,40. rRNA é a maior parte do RNA total e é m5C metilado em muitos organismos. Prepare com antecedência transcrições in vitro (IVT) para serem usadas como sequências de RNA de controle e adicione-as nas amostras. Produzir dois IVTs distintos usando um kit de transcrição in vitro, um com nucleosídeos não metilados e outro onde o rCTP é substituído por 5-metil-rCTP, para servir como controles negativos e positivos no MeRIP, respectivamente. As transcrições preparadas foram as da EGFP e renilla luciferase.NOTA: Os IVTs não devem existir no transcriptome do organismo que você está analisando. Se os IVTs forem do mesmo modelo (por exemplo, ambos EGFP), adicione o controle positivo e negativo em duas amostras diferentes. Se sua sequência for diferente (por exemplo, EGFP e Renilla), elas podem ser adicionadas à mesma amostra. Pico em cada amostra 0,1 ng IVT por 3 μg de RNA, como controles. Sonicar o RNA para aproximadamente 100 fragmentos.NOTA: As condições para a cisalhamento de RNA devem ser ajustadas com antecedência e diferem para cada sonicator. Para o modelo utilizado aqui, a sônica é realizada com as seguintes condições: Pico de potência 174, Fator dever 10, Ciclos/estouro 200, 17 min. Sonicate a mesma quantidade de RNA para todas as amostras, pelo menos 12 μg RNA por amostra em 80 μL de volume total (min 60 μL, máximo 100 μL), preenchido com H2O sem RNase. Confirme a eficiência da sônica e a concentração das amostras de RNA por eletroforese capilar. O tamanho médio do RNA fragmentado deve ser de cerca de 100 nt. 2. Imunoprecipitação de RNA metilada (MeRIP) Em tubos de baixa ligação, adicione 9 μg de RNA sonicado e H2O sem RNase até 60 μL (ou mais, dependendo da concentração). Dissociar as estruturas secundárias aquecendo o RNA a 70 °C em um banho de água por 10 minutos e esfriando por mais 10 minutos em uma mistura de água gelada. Divida a amostra em três partes: um terço (20 μL, se 60 μL foram tomados na etapa 2.1) é salvo em um tubo separado a -80 °C como a amostra de entrada. Encha os 40 μL restantes com H2O sem RNase até 860 μL e depois divida em dois tubos de baixa ligação: um para IP e outro para o controle Mock (430 μL cada). Adicione aos dois tubos:50 μL de tampão MeRIP 10×10 μL do inibidor de RNase10 μL de anticorpo α-m5C (10 μg) na amostra IP por 10 μL de H2O na amostra MockNOTA: O clone de anticorpos usado anteriormente não está mais disponível comercialmente. No entanto, qualquer anticorpo monoclonal anti-5-metilcittosina deve funcionar da mesma forma. Os anticorpos devem ser testados para especificidade antes de utilizados para MeRIP11,23. Sele os tubos com parafilm e incubar por 12-14 horas a 4 °C, com rotação aérea. No dia seguinte, prepare as contas magnéticas da proteína G para a ligação. Para cada tubo (controle IP ou Mock), use 40 μL de contas. Adicione a quantidade total de contas (# de tubos x 40 μL, por exemplo, para 2 amostras de IP e 2 Simuladas, são necessários 160 μL de contas) em um tubo de 15 mL e lavar três vezes com 800 μL de 1x tampão MeRIP por amostra (# de tubos x 800 μL tampão, por exemplo, 3,2 mL para 2 amostras DE IP e 2 Simulações). Realizar lavagens em temperatura ambiente por 5 minutos com rotação aérea, coletar as contas com a ajuda de um rack magnético e descartar o tampão de lavagem. Após a terceira lavagem, resuspenque as contas no mesmo volume de 1x tampão MeRIP como o volume inicial de contas colhidas (# de tubos x 40 μL, por exemplo, 160 μL de 1x tampão MeRIP para 2 ip e 2 amostras simuladas).NOTA: A quantidade de proteínas G utilizadas é determinada pela capacidade de vinculação das contas para o tipo de anticorpo específico e a quantidade de anticorpos utilizados. Neste caso, as contas têm uma capacidade de ligação de aproximadamente 8 μg de IgG por mg de contas e concentração de 30 mg/mL. Portanto, 40 μL são suficientes para ligar aproximadamente 9,6 μg de anticorpo. Adicione 40 μL de contas resuspendadas a cada amostra IP e Mock e incubar por 2 horas adicionais a 4 °C, com rotação aérea. Coloque os tubos em um rack magnético por 1 min e descarte o supernatante ou salve-o como um controle (amostra de RNA não vinculada). Lave as contas 5 vezes por resuspending em 700 μL de 1x tampão MeRIP fornecido com 0,01% Tween 20 e incubação por 10 minutos em temperatura ambiente com rotação aérea. Resuspengue as contas lavadas em 200 μL de tampão de digestão Proteinase K e adicione 3,5 μL de Proteinase K. Incubar por 3 horas a 50 °C, tremendo a 800 rpm. Ocasionalmente, gire manualmente a parte inferior do tubo se um sedimento de contas estiver se formando durante a incubação. Extrair o RNA por adição de 800 μL de reagente de extração de RNA e seguindo um protocolo de extração de tiocianato-fenol-clorofórdo ácido de guanidinium, e continuar como na etapa 1.2. Para aumentar a visibilidade da pelota de RNA, um co-precipitante colorido pode ser adicionado em isopropanol na etapa de precipitação. Resuspenha a pelota em 20 μL de H2O sem RNase (ou igual ao volume de entrada mantido na etapa 2.3). 3. Análise a jusante Envie as amostras de Entrada e IP para sequência de extremidade única com 50 bases de comprimento de leitura (SE50). Corte os adaptadores finais de 3′ usando cutadapt41 e descarte leituras mais curtas que 48 nt. Mapa aparado lê para o genoma arabidopsis (anotação TAIR10) usando STAR42 com um corte de 6% para incompatibilidades e tamanho máximo intron de 10 kb. Mantenha leituras exclusivamente mapeadas para análises posteriores. Identifique fragmentos de RNA enriquecidos em amostras de IP em comparação com a Entrada usando dois métodos distintos e considere aqueles que são encontrados significativamente enriquecidos por ambos. Primeiro, detecte picos de MeRIP-seq usando o pico MACS243 em IPs agrupados versus Entrada. Em segundo lugar, siga a análise para merip-seq peak chamada como descrito em Meyer et al.22 e Yang et al.17. Usando scripts R personalizados, divida o genoma em distintas janelas de 25 nt e conte o número de leituras mapeadas exclusivamente para cada janela com base na posição do último nucleotídeo mapeado (uma vez que as leituras se originam de fragmentos de RNA de 100 nt). Calcule janelas significativamente enriquecidas em amostras de IP em comparação com a entrada com o Teste Exato de Fisher. Use o procedimento Benjamini-Hochberg para corrigir para vários testes. Mantenha os picos significativamente enriquecidos que se estendem por pelo menos duas janelas consecutivas e descarte picos que cobrem apenas uma janela. Identificar regiões anotadas do genoma (transcrições) com picos significativamente enriquecidos encontrados por ambos os métodos. Alternativamente ou complementarmente, teste metas específicas de RNA para seu enriquecimento nas amostras de IP. Transcreva inversa o RNA (mesmo volume de amostras de Entrada, IP e Mock) com hexamers aleatórios. Execute pcr quantitativo em tempo real nos alvos escolhidos, comparando Entrada, IP e Simulação através do método ΔΔCt.NOTA: O produto gerado não deve ser superior a 100 bp, pois este é o tamanho médio da fragmentação.

Representative Results

Um esquema do método é fornecido na Figura 1. Os primeiros passos críticos do protocolo são obter RNA de boa qualidade (RIN ≥ 7) e sonicá-lo para aproximadamente 100 fragmentos nt. A eficiência de ambas as etapas é examinada por uma máquina de eletroforese capilar baseada em chip. Na Figura 2A, uma execução representativa de uma boa amostra de RNA é mostrada. A amostra é diluída 1:10 antes de carregar no chip, a fim de ter uma concentração que está na faixa de detecção do kit utilizado (5-500 ng/μL). A mesma amostra também é executada após a sônica e é mostrada na Figura 2B. Observe que a presença de um pico uniforme deslocado para a esquerda do diagrama, em um tamanho de cerca de 100 nucleotídeos. A menor concentração é causada tanto pela perda de RNA durante a fragmentação, como também pelo aumento do volume das amostras (60-100 μL, etapa 1.7.1). A qualidade das amostras IP e Mock pode ser avaliada por qRT-PCR. Para isso, os IVTs cravados servem como controles positivos e negativos: o IVT metilado, onde em todas as posições de citosina há m5C, deverá ser altamente enriquecido na amostra de IP; pelo contrário, o IVT não metilado não deve ter diferença entre IP e Mock. Os primers utilizados no ensaio qRT-PCR para os dois IVTs de controle(EGFP e Renilla luciferase) estão listados na Tabela 1. De fato, como mostrado na Figura 3,cerca de 80% do IVT metilado foi recuperado na amostra de IP, e apenas aproximadamente 2% no Mock. Para o controle não metilado, a recuperação foi inferior a 1% em amostras de IP e Mock. Isso verifica a eficiência do MeRIP de que fragmentos de RNA metilado foram precipitados e enriquecidos, e é um bom indicador de que as amostras podem ser usadas para análise a jusante. Além disso, o enriquecimento da dobra do IVT não metilado (razão IP para Mock) pode ser aplicado como um limiar para estimar a significância do enriquecimento nos ensaios qRT-PCR. Após o alinhamento das leituras ao genoma(Figura 4),os algoritmos de chamada de pico descritos nas etapas 3.4.1 e 3.4.2 são aplicados para identificar as janelas estatisticamente significativas, enriquecidas nas amostras de IP em comparação com a Entrada. As sequências que correspondem a essas janelas podem ser utilizadas ainda mais, por exemplo, para procurar motivos conservados relacionados à metilação11,17. Figura 1: Representação esquemática do protocolo MeRIP-seq.As amostras de RNA são incubadas com um anticorpo para citosinas de 5 metilados e os complexos são puxados para baixo com contas magnéticas G proteínas que capturam os anticorpos juntamente com o RNA ligado. As amostras de RNA elucidas são analisadas por sequenciamento profundo e qRT-PCR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Resultados representativos da análise da qualidade das amostras de RNA.(A) Perfil representativo de uma amostra total qualificada da planta RNA. (B) Perfil representativo de uma amostra de RNA após a sônica para fragmentos de 100 nt. Arquivos de saída do software de eletroforese capilar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: qRT-PCR análise de IVTs de controle.Transcrições in vitro metiladas e não metiladas foram utilizadas como controles positivos e negativos do ensaio MeRIP, respectivamente. Após a imunoprecipitação, o IVT metilado é altamente enriquecido na amostra IP (verde), mas não na amostra Mock (sem anticorpo anti-m5C; roxo). O IVT não metilado não mostrou enriquecimento e nenhuma diferença entre IP e Mock. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Leia o alinhamento antes e depois do MeRIP em torno de uma transcrição representativa.Leituras alinhadas a uma transcrição específica na amostra de entrada (linha superior) e em duas réplicas IP (linha média e inferior). A caixa preta mostra uma janela de 50 nt de comprimento enriquecida identificada com base nas análises macs243 e MeRIP-seq22 peak-calling. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Alvo Par de primer Sequência do produto Comprimento do produto EGFP Para: 5′- GGCAACTACAAGACCCGCGCC -3′ GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC 72 bp Rev: 5′- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3′ Renilla luciferase Para: 5′-GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAAC -3′ GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACCATGTTGCCATCAAAAAATCATGAGAAAGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC 75 bp Rev: 5′- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAA -3′ Tabela 1: Informações sobre os primers e produtos gerados para a análise qRT-PCR. Receitas tampão. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

O RNA carrega mais de cem modificações de base distintas4 que formam o epitranscriptome44. Essas modificações adicionam uma camada adicional de regulação da tradução e sinalização (revisada em5,6,8,20,45,46). Estudos iniciais foram capazes de detectar a presença de modificações pós-transcrição no RNA28,47, mas as RNAs modificadas específicas precisam ser identificadas para entender o papel da epitranscriptomia. O MeRIP foi projetado como um método para mapear os sites de metilação de RNA transcriptome-wide21,22. Pode ser adaptado a qualquer modificação, se um anticorpo específico estiver disponível.

A principal força deste protocolo é que é relativamente simples, seguro para o RNA e para o usuário (por exemplo, 5-azaC é altamente tóxico para plantas e seres humanos) e não requer sequência ou modificação de informações enzimáticas. Além disso, o enriquecimento de RNAs metiladas pelo PI aumenta as chances de baixa abundância de mRNAs serem detectados, ao contrário do sequenciamento de bisulfoto que não contém um passo de enriquecimento. Quando duas rodadas seriais de MeRIP são realizadas, o enriquecimento em fragmentos de RNA contendo locais de metilação aumenta ainda mais22. Uma das limitações do MeRIP, especialmente quando aplicado aos estudos de metilação de mRNA, é a alta quantidade de RNA necessária como insumo para o ensaio. A etapa de ribodepletion – ou poli(A) – reduzirá o fundo causado pelo RNA ribossômico fortemente modificado, mas remove mais de 90% do RNA total. O DNA também deve ser completamente removido, pois é rico em citosinas de 5 metilados. Outra desvantagem é a menor resolução da posição exata da metilação. A sônicação do RNA antes da incubação com o anticorpo ajuda nessa direção, reduzindo a região contendo a modificação para 100-200 nucleotídeos. Quando o MeRIP é combinado com sequenciamento profundo, a resolução da previsão do local m5C aumenta à medida que as leituras de sequenciamento formam uma distribuição gaussiana em torno do potencial local de metilação. Além disso, a especificidade do anticorpo precisa ser confirmada antes do ensaio (por exemplo, com ensaios de manchas de ponto RNA, realizadas com oligos sintetizados com nucleotídeos modificados), no entanto, até que ponto um anticorpo pode realmente distinguir entre modificações intimamente relacionadas (por exemplo, m6A e m6Am) é um ponto de discussão no campo48,49. Além disso, rnas altamente estruturadas podem interferir na interação anticorpo-antígeno, outra restrição que é abordada principalmente com fragmentação e desnaturação do RNA antes do PI. Pelo contrário, o sequenciamento de bisulfotos que também é afetado por estruturas secundárias, não inclui um passo de fragmentação e isso pode ser uma das razões que causa discrepância entre os locais m5C e mRNAs previstos pelo sequenciamento de bisulfoto16 e MeRIP-seq11,17. Outras modificações de citosina (por exemplo, hm5C) também são resistentes à deaminação mediada por bisulfato35.

As modificações do MeRIP-seq incluem uma etapa de crosslinking, seja com a introdução de um ribonucleoídeo fotoactivatable (foto-crosslinking assistido m6A-seq, PA-m6A-seq 50) ou usando luz UV para criar crosslinks anticorpo-RNA após o IP (miCLIP49, método diferente do miCLIP descrito introdução em30, mas também com resolução individual-nucleotide). No futuro, e à medida que o conhecimento sobre a metilação de RNA está se acumulando, abordagens mais direcionadas podem ser preferíveis, com base nas enzimas modificadoras e/ou nas sequências de consenso onde a metilação está aparecendo. A identificação de proteínas leitoras é essencial para a compreensão da função molecular e de sinalização das modificações pós-transcricionais. A tecnologia de sequenciamento de nanoporos já permite a identificação direta de nucleotídeos modificados sem tratamento prévio do RNA17, mas ainda há espaço para melhorias neste campo em relação à profundidade da sequência e à análise bioinformática. No geral, o MeRIP-seq é atualmente uma abordagem estabelecida, confiável e imparcial para identificar transcrições de RNA metiladas.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por um subsídio de doutorado do IMPRS à E.S, uma Bolsa de Longo Prazo da EMBO para v.P., e fundos internos do MPI-MPP para f.K. Parte deste trabalho também foi financiado através do PLAMORF, um projeto que recebeu financiamento do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC) sob o programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia (Grant Agreement No. Os autores gostariam de agradecer a Federico Apelt pela análise bioinformática e comentários sobre o manuscrito, e Mathieu Bahin e Amira Kramdi pela análise bioinformática.

Materials

α‐m5C antibody ZymoResearch A3001 (discontinued), A3002 available Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available
Chip and reagents for capillary electrophoresis Agilent 5067-1511 RNA 6000 Nano kit
Dnase Ambion AM1907 TURBO DNA-free kit
Co-precipitant of nucleic acids Ambion AM9515 Glycoblue, 15 mg/mL
In vitro transcription kit Promega P1300 T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System
Low-binding reaction tubes Kisker Biotech G017 1.7 ml microcentrifuge tubes
Protein G magnetic beads Invitrogen 10003D Dynabeads Protein G
Proteinase K Ambion AM2546 20mg/mL stock solution, RNA grade
RNase inhibitor Promega N2615 RNasin Plus 40 U/μl
rRNA removal kit Epicentre RZPL11016 Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)
Sonication tubes Covaris 520045 microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm
RNA extraction reagent Ambion 15596018 TRIzol reagent
Equipment
Capillary electrophoresis machine Agilent G2939BA 2100 Bioanalyzer System
Magnetic rack Invitrogen 12321D DynaMag-2
Microentrifuge Eppendorf discontinued 5417R model
Rotator Benchmark R4040 RotoBot Mini
Sonicator Covaris 500217 S220 Focused-ultrasonicator
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONEC-W NanoDrop OneC
Waterbath GFL 1012 1012 Incubation bath
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References

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Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (159), e61231, doi:10.3791/61231 (2020).
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