Detectie van eiwit s-acylation met behulp van Acyl-Hars Assisted Capture

S-acylation is een omkeerbare posttranslationele modificatie waarbij een vetacylketen wordt toegedeeld aan een intern cysteïneresidu op een doeleiwit via een labiele thioesterbinding¹. Het werd voor het eerst gemeld als een wijziging van eiwitten met palmitaat, een verzadigd 16-koolstofvetzuur², en daarom wordt deze wijziging vaak aangeduid als S-palmitoylation. Naast palmitaat kunnen eiwitten omkeerbaar worden gewijzigd door een verscheidenheid aan langere en kortere verzadigde (myristaat en stearate), enkelvoudig onverzadigd (oleaat) en meervoudig onverzadigd (arachidonaat en eicosapentanoaat) vetzuren^3,4,5,6,7. In eukaryotische cellen wordt S-acylation gekatalyseerd door een familie van enzymen die bekend staan als DHHC-eiwitacyltransferases en de omgekeerde reactie van cysteinedeacylation wordt gekatalyseerd door eiwitthioesterases, waarvan de meeste nog steeds^{raadselachtig}8 blijven.

De laaitbaarheid van de thioesterbinding maakt deze lipidemodificatie omkeerbaar, waardoor het eiwitclustering, plasmamembraanlokalisatie, intracellulaire handel, eiwit-eiwitinteracties en eiwitstabiliteit⁹,^10kandynamisch reguleren. Bijgevolg is S-acylation gekoppeld aan verschillende aandoeningen, waaronder de ziekte van Huntington, de ziekte van Alzheimer en verschillende vormen van kanker (prostaat, maag, blaas, long, colorectale), die de ontwikkeling van betrouwbare methoden om deze post-translationele eiwitmodificatie te detecteren^{vereist 11}.

Metabolische etikettering met radioactief ([³H], [¹⁴C] of [¹²⁵I]) palmitaat was een van de eerste benaderingen ontwikkeld om testeiwit S-acylation^12,13,14. Echter, radiolabeling-gebaseerde methoden presenteren gezondheidsproblemen, zijn niet erg gevoelig, tijdrovend, en alleen detecteren lipidatie van zeer overvloedige eiwitten¹⁵. Een sneller en niet-radioactief alternatief voor radiolabeling is metabolische etikettering met bioorthogonale vetzuursondes, die routinematig wordt gebruikt om de dynamiek van eiwit S-acylation¹⁶te assay. Bij deze methode wordt een vetzuur met een chemische reporter (alkyne of azidegroep) door een eiwit acyltransferase in het S-acylated eiwit verwerkt. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reactie (klik chemie) kan vervolgens worden gebruikt om een gefunctionaliseerde groep, zoals een fluoroftaan of biotine, hechten aan het geïntegreerde vetzuur waardoor detectie van de S-acylated eiwit^17,18,19.

Acyl-biotine uitwisseling (ABE) is een van de veel gebruikte biochemische methoden voor het vangen en identificeren van S-acylated eiwitten die een aantal van de tekortkomingen van metabole etikettering omzeilt, zoals ongeschiktheid voor weefselmonsters¹⁵. Deze methode kan worden toegepast voor de analyse van S-acylation in een breed scala van biologische monsters, waaronder weefsels en diepgevroren celmonsters^20,21. Deze methode is gebaseerd op selectieve decolleté van de thioesterbinding tussen de acylgroep en het cysteïneresidu door neutrale hydroxylamine. De bevrijde thiolgroepen worden vervolgens gevangen met een thiol-reactief biotinederivaat. De gegenereerde bioatlateeiwitten worden vervolgens affiniteitgezuiverd met streptavidinaaga en geanalyseerd door immunoblotting.

Een alternatieve aanpak genoemd acyl-hars bijgestaan vangen (Acyl-RAC) werd later geïntroduceerd om de biotinylation stap te vervangen door directe vervoeging van vrije cysteïnedoor een thiol-reactieve hars^22,23. Deze methode heeft minder stappen in vergelijking met ABE en kan op dezelfde manier worden gebruikt om eiwit S-acylation te detecteren in een breed scala van monsters¹.

Acyl-RAC bestaat uit 4 hoofdstappen (figuur 1),
1. Blokkering van vrije thiolgroepen;
2. Selectieve splitsing van de cysteïne-acylthioesterbinding met neutrale hydroxylamine (HAM) om cysteïnethiolgroepen bloot te leggen;
3. Het vastleggen van de lipide cysteïnen met een thiol-reactieve hars;
4. Selectieve verrijking van de S-acylated eiwitten na elutie met reducerende buffer.

De gevangen eiwitten kunnen vervolgens worden geanalyseerd door immunoblotting of onderworpen aan massaspectrometrie (MS) gebaseerde proteomics om het S-acylated proteome te beoordelen in een gevarieerd scala van soorten en weefsels^22,24,25. Individuele S-acylation sites kunnen ook worden geïdentificeerd door trypsine vertering van de gevangen eiwitten en analyse van de resulterende peptiden door LC-MS/MS²². Hier laten we zien hoe acyl-RAC kan worden gebruikt voor gelijktijdige detectie van S-acylation van meerdere eiwitten in zowel een cellijn als een weefselmonster.