Summary

Detección de proteína S-Acylation utilizando la captura asistida de acilo-resina

Published: April 10, 2020
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Summary

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) es un método altamente sensible, confiable y fácil de realizar para detectar la modificación reversible de los residuos de cisteína (S-acylation) en una variedad de muestras biológicas.

Abstract

La proteína S-acylation, también conocida como S-palmitoylation, es una modificación post-traduccional reversible de residuos de cisteína con ácidos grasos de cadena larga a través de un enlace labile tioester. La acilación S, que está emergiendo como un mecanismo regulador generalizado, puede modular casi todos los aspectos de la actividad biológica de las proteínas, desde la formación compleja hasta el tráfico de proteínas y la estabilidad de las proteínas. Los recientes avances en la comprensión de la función biológica de la proteína S-acylation se lograron en gran medida debido al desarrollo de nuevas herramientas bioquímicas que permitieron la detección robusta y sensible de la proteína S-acylation en una variedad de muestras biológicas. Aquí, describimos la captura asistida por resina de acilo (Acyl-RAC), un método desarrollado recientemente basado en la captura selectiva de proteínas endógenamente S-aciladas por cuentas de sepharose tiol-reactivas. En comparación con los enfoques existentes, Acyl-RAC requiere menos pasos y puede producir resultados más fiables cuando se combina con espectrometría de masas para la identificación de nuevos objetivos de acilación S. Una limitación importante en esta técnica es la falta de capacidad para discriminar entre especies de ácidos grasos unidos a las cisteínas a través del mismo enlace tioester.

Introduction

La acilación S es una modificación post-traduccional reversible que implica la adición de una cadena de acilo graso a un residuo interno de cisteína en una proteína diana a través de una unión labile tioester1. Primero se informó como una modificación de proteínas con palmitato, un ácido graso saturado de 16 carbonos2,y por lo tanto esta modificación se conoce a menudo como S-palmitoylation. Además del palmitato, las proteínas pueden ser modificadas reversiblemente por una variedad de ácidos grasos saturados más largos y más cortos (miristate y estearato), monoinsaturados (oleato) y poliinsaturados (araquidonato y eicosapentanoato)3,4,5,6,7. En las células eucariotas, la acilación S es catalizada por una familia de enzimas conocidas como aciltransferasas de proteína DHHC y la reacción inversa de la deccilación de cisteína es catalizada por tilanarias de proteína, la mayoría de las cuales siguen siendo enigmáticas8.

La labilidad del enlace tioester hace que esta modificación lipídica sea reversible, lo que le permite regular dinámicamente el clustering de proteínas, la localización de membranas plasmáticas, el tráfico intracelular, las interacciones proteína-proteína y la estabilidad de proteínas9,,10. En consecuencia, la acilación S se ha relacionado con varios trastornos, incluyendo la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Alzheimer y varios tipos de cáncer (próstata, gástrico, vejiga, pulmón, colorrectal), que requiere el desarrollo de métodos confiables para detectar esta modificación de proteína post-traduccional11.

El etiquetado metabólico con palmitato radiactivo ([3H], [14C] o [125I]) fue uno de los primeros enfoques desarrollados para analizar la proteína S-acylation12,13,14. Sin embargo, los métodos basados en radioetiquetado presentan problemas de salud, no son muy sensibles, consumen mucho tiempo y sólo detectan la lipidedeción de proteínas altamente abundantes15. Una alternativa más rápida y no radioactiva al radioetiquetado es el etiquetado metabólico con sondas de ácidos grasos bioortogonales, que se utiliza rutinariamente para analizar la dinámica de la proteína S-acylation16. En este método, un ácido graso con un reportero químico (grupo de alquino o azida) se incorpora a la proteína S-acilado por una proteína acitransferasa. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reaction (clic chemistry) se puede utilizar para unir un grupo funcionalizado, como un fluoróforo o biotina, al ácido graso integrado que permite la detección de la proteína S-acylated17,18,19.

El intercambio de acilina-acilo (ABE) es uno de los métodos bioquímicos ampliamente utilizados para la captura e identificación de proteínas s aciladas que evita algunas de las deficiencias del etiquetado metabólico, como la inadecuación para las muestras de tejido15. Este método se puede aplicar para el análisis de S-acylation en una amplia gama de muestras biológicas, incluyendo tejidos y muestras de células congeladas20,,21. Este método se basa en el escote selectivo del enlace tioéster entre el grupo de acilo y el residuo de cisteína por hidroxilamina neutra. Los grupos tiol liberados son capturados con un derivado de la biotina tiol-reactivo. Las proteínas biotiniladas generadas se purifican con afinidad mediante agarosa de estreptavidina y se analizan mediante inmunoblotting.

Más tarde se introdujo un enfoque alternativo llamado captura asistida de acilo-resina (Acyl-RAC) para reemplazar el paso de biotinylación por la conjugación directa de cisteínas libres por una resina tio-reactiva22,23. Este método tiene menos pasos en comparación con ABE y de forma similar se puede utilizar para detectar la proteína S-acylation en una amplia gama de muestras1.

Acyl-RAC consta de 4 pasos principales(Figura 1),
1. Bloqueo de grupos de tiol libres;
2. Escisión selectiva de la unión tioester de cisteína-acyl con hidroxilamina neutra (HAM) para exponer los grupos de tiol de cisteína;
3. Captura de las cisteínas lipicadas con una resina tiol-reactiva;
4. Enriquecimiento selectivo de las proteínas S-acylated después de la elución con tampón reductor.

Las proteínas capturadas pueden ser analizadas mediante inmunoblotting o sometidas a espectrometría de masas (MS) proteómica para evaluar el proteoma S-acilado en una variada gama de especies y tejidos22,,24,,25. Los sitios individuales de S-acylation también pueden ser identificados por la digestión de la trippsina de las proteínas capturadas y el análisis de los péptidos resultantes por LC-MS/MS22. Aquí, demostramos cómo acile-RAC se puede utilizar para la detección simultánea de S-acylation de múltiples proteínas tanto en una línea celular como en una muestra de tejido.

Protocol

Los ratones utilizados en este protocolo fueron eutanasiados de acuerdo con las directrices de NIH. El Comité de Bienestar Animal del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en Houston aprobó todo el trabajo animal. 1. Preparación de los lysaatos celulares Prepare el búfer de lisis como se describe en la Tabla 1. A 10 ml de PBS, añadir 0,1 g de detergente n-dodecílo-D-maltoside (DDM) y rotar para disolver. Añadir 100 l de cóctel inhibidor de…

Representative Results

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, primero usamos acyl-RAC para detectar simultáneamente S-acylation de varias proteínas en las células de Jurkat, una línea de células T inmortalizada originalmente derivada de la sangre periférica de un paciente de leucemia de células T27. Las proteínas de células T reguladoras previamente identificadas como S-acylated9,28,29 fueron elegidas para demo…

Discussion

Aquí, utilizamos con éxito el ensayo acyl-RAC para detectar La acilación S de proteínas seleccionadas tanto en células humanas cultivadas como en células primarias derivadas del tejido del ratón. Este método es simple, sensible y se puede realizar fácilmente con requisitos mínimos de equipos utilizando técnicas de bioquímica estándar. Se ha demostrado que este método identifica con éxito nuevas proteínas S-aciladas, como la subunidad del sistema de transubicación de proteínas (Sec61b), la proteína ribo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por las becas 5R01GM115446 y 1R01GM130840 de los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets Sigma 11836170001
Eppendorf Centrifuge 5424 Eppendorf 22620444
Hydroxylamine (HAM) Sigma 159417
Methyl methanethiosulfonate (MMTS) Sigma 64306
Mini tube rotator LabForce
ML211 Cayman 17630
Multi-Therm Cool-Heat-Shake Benchmark Scientific H5000-HC
n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) Sigma D641
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Sigma P5726
Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) Sigma T8387
Ultrasonics Quantrex Sonicator L & R

References

  1. Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).
  2. Magee, A. I., Courtneidge, S. A. Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells. EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).
  3. Fujimoto, T., et al. P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage. Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).
  4. DeMar, J. C., Anderson, R. E. Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver. Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).
  5. Montigny, C., et al. S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin. Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).
  6. Muszbek, L., Laposata, M. Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets. Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).
  7. Hallak, H., et al. Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).
  8. Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. Discovery of protein-palmitoylating enzymes. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. , 1206 (2008).
  9. Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids. Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).
  10. Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck. Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).
  11. Blanc, M., et al. SwissPalm: Protein Palmitoylation database. F1000Research. 4, 1-23 (2015).
  12. O’Brien, P. J., Zatz, M. Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid. Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).
  13. Drahansky, M., et al. We are IntechOpen , the world’s leading publisher of Open Access books Built by scientists. Intech. 13, (2016).
  14. Resh, M. D. Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation. Methods. 40 (2), 191-197 (2006).
  15. Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).
  16. Martin, B. R., Cravatt, B. F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells. Nature Methods. 6, 135-138 (2009).
  17. Rami, N., Hannoush, N. A. -. R. Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins. ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).
  18. Kostiuk, M. A., et al. Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue. FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).
  19. Charron, G., et al. Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters. Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).
  20. Roth, A. F., et al. Global analysis of protein palmitoylation in yeast. Cell. 125, 1003-1013 (2006).
  21. Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).
  22. Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
  23. Guo, J., et al. Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
  24. Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).
  25. Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  26. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and activation of murine lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).
  27. Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative “null” and “T” cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).
  28. Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).
  29. Hundt, M., et al. Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells. Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).
  30. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).
  31. Brdicka, T., et al. Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation. Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).
  32. Akimzhanov, A. M., Boehning, D. Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).
  33. Stetsenko, A., Guskov, A. An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7 (7), (2017).
  34. Adibekian, A., et al. Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2). Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).
  35. Dekker, F. J., et al. Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling. Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).
  36. Zhou, B., et al. Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis. Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).
  37. Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).
  38. Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).

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Tewari, R., West, S. J., Shayahati, B., Akimzhanov, A. M. Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture. J. Vis. Exp. (158), e61016, doi:10.3791/61016 (2020).

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