Detecção de Proteína S-Acilação usando captura assistida de acila-resina

A s-acilação é uma modificação pós-translacional reversível que envolve a adição de uma cadeia de acila gordurosa a um resíduo de cisteína interna em uma proteína alvo através de uma ligação de thioester labile¹. Foi relatado pela primeira vez como uma modificação de proteínas com palmitato, um ácido graxo saturado de 16^{carbonos 2}, e, portanto, esta modificação é frequentemente referida como S-palmitoylation. Além do palmitato, as proteínas podem ser reversivelmente modificadas por uma variedade de ácidos graxos mais longos e curtos saturados (myristate e esteato), monoinsaturados (oleato) e poliinsaturados (aracidonate e eicosapentanoato) ácidos graxos^3,4,5,6,7. Em células eucarióticas, a s-acilação é catalisada por uma família de enzimas conhecidas como aciltransferases de proteína DHHC e a reação reversa da deacinada cisteína é catalisada por thioesterases protéicas, a maioria das quais ainda permanecem enigmáticas⁸.

A labilidade da ligação tioester torna reversível essa modificação lipídica, permitindo-lhe regular dinamicamente o agrupamento de proteínas, a localização da membrana plasmática, o tráfico intracelular, as interações proteína-proteína e a estabilidade proteica^9,10. Consequentemente, a s-acilação tem sido associada a vários distúrbios, incluindo a doença de Huntington, doença de Alzheimer e vários tipos de câncer (próstata, gástrico, bexiga, pulmão, colorretal), o que requer o desenvolvimento de métodos confiáveis para detectar essa modificação proteica pós-translacional¹¹.

A rotulagem metabólica com palmitato radioativo^([3H], [¹⁴C] ou [¹²⁵I]) foi uma das primeiras abordagens desenvolvidas para ensaio de proteína S-acilação^12,13,14. No entanto, os métodos baseados em rotulagem por radiorotulagem apresentam preocupações de saúde, não são muito sensíveis, demorados e detectam apenas lipidação de proteínas altamente abundantes¹⁵. Uma alternativa mais rápida e não radioativa à rotulagem radioativa é a rotulagem metabólica com sondas de ácidos graxos bioortogonais, que é usada rotineiramente para ensaio dinâmico da proteína S-acilação¹⁶. Neste método, um ácido graxo com um repórter químico (grupo alquina ou azida) é incorporado na proteína S-acylated por uma proteína aciltransferase. A reação de cicloadição de Azide-alquino Huisgen (química do clique) pode então ser usada para anexar um grupo funcionalizado, como um floróforo ou biotina, ao ácido graxo integrado que permite a detecção da proteína S-acylated^17,18,19.

A troca de acilina (ABE) é um dos métodos bioquímicos amplamente utilizados para captura e identificação de proteínas S-acyladas que ignora algumas das deficiências da rotulagem metabólica, como a inadequação para amostras de tecido¹⁵. Este método pode ser aplicado para análise da s-acilação em uma variedade diversificada de amostras biológicas, incluindo tecidos e amostras de células congeladas^20,21. Este método baseia-se no decote seletivo da ligação tioester entre o grupo acile e o resíduo de cisteína por hidroxilamina neutra. Os grupos thiol liberados são então capturados com um derivado de biotina tiol-reativo. As proteínas biotinyladas geradas são então purificadas por afinidade usando agarose de streptavidin e analisadas por imunoblotting.

Uma abordagem alternativa denominada captura assistida de acilina (Acyl-RAC) foi posteriormente introduzida para substituir a etapa de biotinylation por conjugação direta de cisteínas livres por uma resina tiol-reativa^22,23. Este método tem menos passos em comparação com a ABE e da mesma forma pode ser usado para detectar aciação de proteína S em uma ampla gama de amostras¹.

A Cil-RAC consiste em 4 passos principais (Figura 1),
1. Bloqueio de grupos de tiol livres;
2. Decote seletivo da ligação cisteine-acila thioester com hidroxilamina neutra (HAM) para expor grupos de cisteína thiol;
3. Captura das cisteínas lipidados com resina tiol-reativa;
4. Enriquecimento seletivo das proteínas S-acylated após elução com a redução do tampão.

As proteínas capturadas podem então ser analisadas por imunoblotting ou submetidas à espectrometria de massa (MS) para avaliar o proteoma s-acylado em uma variedade variada de espécies e tecidos^22,24,25. Os locais individuais de s-acilação também podem ser identificados pela digestão da tripsina das proteínas capturadas e análise dos peptídeos resultantes por LC-MS/MS²². Aqui, demonstramos como a acil-RAC pode ser usada para detecção simultânea de s-acilação de múltiplas proteínas em uma linha celular e uma amostra de tecido.