アシル樹脂アシスト捕捉によるプロテインS-アシル化の検出

S-アシル化は、陰唇チオエステル結合¹を介して標的タンパク質上のシステイン残基に脂肪アシル鎖を付加することを含む可逆的な翻訳後修飾である。それはパルミテ酸塩、飽和16-炭素脂肪酸²を有するタンパク質の修飾として最初に報告された、したがって、この修飾は、しばしばS-パルミトイル化と呼ばれる。パルミチン酸に加えて、タンパク質は、様々な長く短い飽和(ミリステイトおよびステアレート)、一価不飽和(オレ酸塩)および多価不飽和(アラキドキおよびエイコサペンタノエート)脂肪酸^{33、4、5、6、74,5,6,7}によって可逆的に修飾することができる。真核細胞において、S-アシル化はDHHCタンパク質アシルトランスセラーゼとして知られる酵素ファミリーによって触媒され、システイン脱アシル化の逆反応はタンパク質チオエステラーゼによって触媒され、そのほとんどは依然として謎8^{のままである。}

チオスター結合の可射性により、この脂質修飾を可逆的にし、タンパク質のクラスタリング、細胞質膜局在、細胞内の密売、タンパク質相互作用およびタンパク質安定性^99,1010を動的に調節することを可能にする。その結果、S-アシル化は、ハンチントン病、アルツハイマー病およびいくつかのタイプの癌(前立腺癌、胃、膀胱、肺、大腸)を含むいくつかの障害に関連しており、この翻訳後タンパク質改変¹¹を検出するための信頼できる方法の開発を必要とする。

パルミテは、放射性([3H]、14C)または^3[125I])を用いた代謝標識は、タンパク質S-アシル化^{12、13、14,13,}をアッセイするために開発された最初のアプローチの¹つである。¹⁴しかしながら、放射線標識ベースの方法は健康上の懸念を提示し、非常に敏感ではなく、時間がかかり、そして非常に豊富なタンパク質¹⁵の脂質を検出するだけである。放射性標識に対するより速く非放射性の代替は、生体直交脂肪酸プローブによる代謝標識であり、これはタンパク質S-アシル化¹⁶の測定ダイナミクスをアッセイするために日常的に使用される。この方法では、化学レポーターを有する脂肪酸(アルキンまたはアジ化基)を、アシルトランスファーーゼタンパク質によってS-acylatedタンパク質に組み込む。アジドアルキン・ウイスゲン・シクロ付加反応(クリック化学)は、フッ素酸またはビオチンなどの官能性基を、S-acylateタンパク質^{17、18、19,18,19}の検出を可能にする集積脂肪酸に付着させるために使用することができる。

アシルビオチン交換(ABE)は、組織サンプル15に不適当な代謝標識の欠点のいくつかをバイパスするS-acylatedタンパク質の捕捉および同定に広く用いられている生化学的方法の^{1つである}。この方法は、組織および凍結細胞試料^20,21,21を含む多様な生物学的サンプルにおけるS-アシル化の分析に適用することができる。この方法は、中性ヒドロキシルアミンによるアシル基とシステイン残基との間のチオエステル結合の選択的切断に基づく。遊離チオール基は、次いでチオール反応性ビオチン誘導体で捕捉される。生成されたビオチン化タンパク質は、ストレプトアビジンアガロースを使用して親和性精製され、免疫ブロッティングによって分析されます。

アシル樹脂アシスト捕捉(Acyl-RAC)と呼ばれた代替アプローチは、後に、シオール反応性樹脂^22,23,23による遊離システインの直接結合と共にビオチン化ステップを置き換えるために導入された。この方法は、ABEと比較して少ないステップを有し、同様に、サンプル¹の広い範囲でタンパク質S-アシル化を検出するために使用することができる。

Acyl-RACは4つの主要なステップ(図1)で構成されています。
1. 無料チオール群のブロック;
2. システイン-アシルチオエステル結合の選択的切断中性ヒドロキシルアミン (HAM) システインチオール基を露出する;
3. チオール反応性樹脂を用いた脂質化されたシステインの捕獲;
4. 還元バッファーと溶出後の S-acylated タンパク質の選択的濃縮.

次いで、捕捉したタンパク質を免疫ブロッティングにより分析するか、または質量分析(MS)ベースのプロテオミクスを行い、S-acylatedプロテオームを様々な種および組織^{22、24、2524,25}の範囲で評価することができる。²²個々のS-アシル化部位は、捕捉されたタンパク質のトリプシン消化およびLC-MS/MS²²による得られたペプチドの分析によっても同定することができる。ここでは、細胞株と組織サンプルの両方で、複数のタンパク質のS-アシル化を同時に検出するためにacyl-RACを使用する方法を示す。