Acyl-RAC (Acyl-Reçin Destekli Yakalama), çeşitli biyolojik örneklerde sistein kalıntılarının (S-aylasyon) geri dönüşümlü lipid modifikasyonunu tespit etmek için son derece hassas, güvenilir ve kolay bir yöntemdir.
Protein S-aylasyon, ayrıca S-palmitoylation olarak anılacaktır, bir labile tiyoester bağı ile uzun zincirli yağ asitleri ile sistein kalıntıları ters çevrilebilir bir post-çevirici modifikasyonudur. Yaygın bir düzenleyici mekanizma olarak ortaya çıkan S-aylasyonu, kompleks oluşumundan protein ticaretine ve protein stabilitesine kadar proteinlerin biyolojik aktivitesinin neredeyse tüm yönlerini modüle edebilir. Protein S-aylasyonunun biyolojik işlevini anlamada son zamanlarda kaydedilen ilerleme, büyük ölçüde çeşitli biyolojik örneklerde protein S-amilasyonunun sağlam ve hassas bir şekilde algılanmasına olanak sağlayan yeni biyokimyasal aletlerin geliştirilmesi sayesinde gerçekleşetmiştir. Burada, endojen S-acylated proteinlerin tiol-reaktif Sepharose boncuklar tarafından seçici olarak ele geçirilmesine dayanan, son zamanlarda geliştirilen bir yöntem olan acyl reçin destekli yakalamayı (Acyl-RAC) tanımlıyoruz. Mevcut yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, Acyl-RAC daha az adım gerektirir ve yeni S-acylation hedeflerinin belirlenmesi için kütle spektrometresi ile birleştiğinde daha güvenilir sonuçlar verebilir. Bu teknikteki önemli bir sınırlama, aynı tiyoester bağı ile sisteinlara bağlı yağ asidi türleri arasında ayrım yapma becerisinin olmamasıdır.
S-acylation bir labile tiyoesterbağı1 ile bir hedef protein üzerinde bir iç sistein kalıntısı bir yağlı asil zincir eklenmesi içeren bir geri dönüşümlü post-çevirisel modifikasyondur. İlk olarak palmitat ile proteinlerin bir değişiklik olarak bildirilmiştir, doymuş 16-karbon yağ asidi2, ve bu nedenle bu değişiklik genellikle S-palmitoylation olarak adlandırılır. Palmitat ek olarak, proteinler geri daha uzun ve kısa doymuş çeşitli tarafından değiştirilebilir (myristate ve stearate), tekli doymamış (oleat) ve çoklu doymamış (arachidonate ve eikosapentanoat) yağ asitleri3,4,5,6,7. Ökaryotik hücrelerde, S-aylasyon DHHC protein ayltransferazlar olarak bilinen enzimler bir aile tarafından katalize edilir ve sistein deamilasyonu ters reaksiyon protein tiyoesterases tarafından katalize edilir, çoğu hala esrarengiz kalır8.
Tiyoester bağının lability bu lipid modifikasyonu geri dönüşümlü hale getirir, dinamik protein kümelenme düzenleyen izin, plazma membran lokalizasyonu, hücre içi ticareti, protein-protein etkileşimleri ve protein stabilitesi9,10. Sonuç olarak, S-acylation Huntington hastalığı, Alzheimer hastalığı ve kanser çeşitli türleri (prostat, mide, mesane, akciğer, kolorektal) dahil olmak üzere çeşitli bozukluklar ile bağlantılı olmuştur, bu post-çeviriprotein modifikasyonu tespit etmek için güvenilir yöntemlergeliştirilmesini gerektirir11.
Radyoaktif metabolik etiketleme ([3H], [14C] veya [125I]) palmitat, protein S-aylasyonunu saymak için geliştirilen ilk yaklaşımlardan biridir12,13,14. Ancak, radyolabeling tabanlı yöntemler sağlık endişeleri mevcut, çok hassas değildir, zaman alıcı, ve sadece son derece bol proteinlerin lipidasyon tespit15. Radiolabeling için daha hızlı ve radyoaktif olmayan bir alternatif biyoortogonal yağ asidi probları ile metabolik etiketleme, hangi rutin protein S-acylation dinamikleri hesaplamak için kullanılır16. Bu yöntemde, bir kimyasal muhabir (alkine veya azit grubu) ile bir yağ asidi bir protein ayltransferaz tarafından S-asilat protein içine dahil edilmiştir. Azide-alkyne Huisgen sikloek reaksiyonu (tıklama kimyası) daha sonra bir florofor veya biyotin gibi işlevselleştirilmiş bir grup eklemek için kullanılabilir, Entegre yağ asidi S-acylated protein tespiti için izin17,18,19.
Acyl-biotin değişimi (ABE) doku örnekleri için uygun olmayan gibi metabolik etiketleme eksiklikleri bazı atlar S-acylated proteinlerin yakalanması ve belirlenmesi için yaygın olarak kullanılan biyokimyasal yöntemlerden biridir15. Bu yöntem, dokular ve dondurulmuş hücre örnekleri20,21dahil olmak üzere biyolojik örnekler, çeşitli s-acilesyon analizi için uygulanabilir. Bu yöntem, nötr hidroksilin ile asil grup ve sistein kalıntısı arasındaki tiyoester bağının selektif bölünmesine dayanır. Serbest tiyol grupları daha sonra bir tiol-reaktif biotin türevi ile yakalanır. Üretilen biyotinylated proteinler daha sonra afinite-streptavidin agarose kullanılarak saflaştırılmış ve immünoblotting tarafından analiz edilir.
Alternatif bir yaklaşım acyl-reçine destekli yakalama denir (Acyl-RAC) daha sonra bir tiyol-reaktif reçine22,,23tarafından serbest sistein doğrudan konjugasyon ile biyotinylation adım yerine tanıtıldı . Bu yöntem, ABE ile karşılaştırıldığında daha az adıma sahiptir ve benzer şekilde çok çeşitli örneklerde protein S-alasyonunun saptanması için kullanılabilir1.
Acyl-RAC 4 ana adımdan oluşur (Şekil 1),
1. Serbest tiyol gruplarının engellenmesi;
2. Nötr hidroksilin ile sistein-asil tiyoester bağıseçici bölünme (HAM) sistein tiyol grupları ortaya çıkarmak için;
3. Bir tiyol-reaktif resin ile lipideli sistein yakalama;
4. Tampon azaltarak elüsyondan sonra S-asitli proteinlerin seçici zenginleşmesi.
Yakalanan proteinler daha sonra immünoblotting veya kütle spektrometresi (MS) tabanlı proteomik türler ve dokuların çeşitli sitifom değerlendirmek için tabi analiz edilebilir22,24,25. Bireysel S-aylasyon siteleri de yakalanan proteinlerin tripsin sindirim ve LC-MS/MS22ile ortaya çıkan peptidlerin analizi ile tespit edilebilir. Burada, hem hücre hattında hem de doku örneğinde birden fazla proteinin S-amilasyonunun eşzamanlı olarak saptanmasında nasıl asil-RAC kullanılabileceğini gösteriyoruz.
Burada, hem kültürlü insan hücrelerinde hem de fare dokusundan elde edilen birincil hücrelerde seçilen proteinlerin S-aylayasyonunu tespit etmek için asil-RAC analizini başarıyla kullandık. Bu yöntem basit, duyarlı ve standart biyokimya teknikleri kullanılarak minimum ekipman gereksinimleri ile kolayca yapılabilir. Bu yöntem, protein translokasyon sisteminin β-subunit (Sec61b), ribozomal protein S11 (Rps11) ve mikrozomal glutatyon-S-transferaz 3 (MGST3)22gibi yeni S-acylat…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma 5R01GM115446 ve 1R01GM130840 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets | Sigma | 11836170001 | |
Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620444 | |
Hydroxylamine (HAM) | Sigma | 159417 | |
Methyl methanethiosulfonate (MMTS) | Sigma | 64306 | |
Mini tube rotator | LabForce | ||
ML211 | Cayman | 17630 | |
Multi-Therm Cool-Heat-Shake | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) | Sigma | D641 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) | Sigma | T8387 | |
Ultrasonics Quantrex Sonicator | L & R |