Rilevamento di Protein S-Acylation utilizzando Acyl-Resin Assisted Capture

La S-acylation è una modifica post-traduzionale reversibile che comporta l’aggiunta di una catena di acili grassi a un residuo di cisteina interno su una proteina bersaglio tramite un legame di tioestro labile¹. È stato segnalato per la prima volta come una modifica delle proteine con palmitate, un acido grasso 16-carbonio saturo², e quindi questa modifica è spesso indicata come S-palmitoylation. Oltre al palmitato, le proteine possono essere reversibilmente modificate da una varietà di acidi grassi più lunghi e più brevi saturi (miristata e stearate), monoinsaturi (oleati) e polinsaturi (arachidonate ed eicosapentanoa)^acidigrassi 3^,4,5,6,7. Nelle cellule eucariotiche, la S-acylation è catalizzata da una famiglia di enzimi noti come acyltransferesteraes proteici DHHC e la reazione inversa della deacylazione dei cistein è catalizzata da tiosi proteici, la maggior parte dei quali rimangono ancora enigmatici⁸.

La leggibilità del legame di tioestro rende reversibile questa modifica dei lipidi, permettendogli di regolare dinamicamente il clustering proteico, la localizzazione della membrana plasmatica, il traffico intracellulare, le interazioni proteina-proteina e la stabilità proteica^9,10. Di conseguenza, l’acilazione scisa è stata collegata a diversi disturbi tra cui la Malattia di Huntington, il morbo di Alzheimer e diversi tipi di cancro (prostata, gastrica, vescica, polmone, colorettale), che richiede lo sviluppo di metodi affidabili per rilevare questa modifica delle proteine post-traduzionale¹¹.

L’etichettatura metabolica con palmita radioattiva ([³H], [¹⁴C] o [¹²⁵I]) è stato uno dei primi approcci sviluppati per formulare la proteina S-acylation^12,13,14. Tuttavia, i metodi basati sulla radioetichettatura presentano problemi di salute, non sono molto sensibili, richiedono molto tempo e rilevano solo la lipidazione di proteine altamente abbondanti¹⁵. Un’alternativa più veloce e non radioattiva alla radioetichettatura è l’etichettatura metabolica con sonde di acidi grassi bioortogonali, che viene utilizzata regolarmente per testare la dinamica della proteina S-acylation¹⁶. In questo metodo, un acido grasso con un reporter chimico (gruppo alchine o azide) è incorporato nella proteina S-acilato da un acyltransferase proteico. La reazione di cicloaddition Azide-alkyne Huisgen (chimica del clic) può quindi essere utilizzata per attaccare un gruppo funzionato, come un fluoroforo o biotina, all’acido grasso integrato che consente di rilevare la proteina S-acilata^17,18,19.

Lo scambio di acyl-biotin (ABE) è uno dei metodi biochimici ampiamente utilizzati per la cattura e l’identificazione di proteine S-acylated che bypassa alcune delle carenze dell’etichettatura metabolica come l’inadeguatezza per i campioni di tessuto¹⁵. Questo metodo può essere applicato per l’analisi di S-acylation in una vasta gamma di campioni biologici, tra cui tessuti e campioni di cellule congelate^20,21. Questo metodo si basa sulla scissione selettiva del legame tra il gruppo acileere e il residuo di cisteina da idrossilamina neutra. I gruppi tioli liberati vengono poi catturati con un derivato della biotina thiol-reattiva. Le proteine biotinylate generate vengono quindi purificate dall’affinità con streptavidin agarose e analizzate mediante immunoblotting.

Un approccio alternativo chiamato acyl-resina assistita capture (Acyl-RAC) è stato successivamente introdotto per sostituire la fase di biotinylazione con coniugazione diretta di cistein liberi da una resina thiol-reattiva^22,23. Questo metodo ha meno passaggi rispetto ad ABE e allo stesso modo può essere utilizzato per rilevare proteina S-acylation in una vasta gamma di campioni¹.

Acyl-RAC è costituito da 4 passaggi principali (Figura 1),
1. Blocco dei gruppi di thiol liberi;
2. Scissione selettiva del legame cisteina-acilo con idrossilamina neutra (HAM) per esporre i gruppi di cisteina;
3. Cattura dei cistein lipidati con una resina thiol-reattiva;
4. Arricchimento selettivo delle proteine aclatato da S dopo l’eluizione con riduzione del tampone.

Le proteine catturate possono quindi essere analizzate mediante immunoblotting o sottoposte a proteometria di massa (MS) per valutare il proteoma aclato da S in una vasta gamma di specie e tessuti^22,24,25. I singoli siti di S-acylation possono anche essere identificati mediante la digestione della trypsin acquisizione delle proteine catturate e l’analisi dei peptidi risultanti da LC-MS/MS²². Qui, dimostriamo come acyl-RAC può essere utilizzato per il rilevamento simultaneo di S-acylation di più proteine sia in una linea cellulare che in un campione di tessuto.