Обнаружение белка S-Acylation с использованием acyl-Resin Assisted Capture
Summary
Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) является высокочувствительным, надежным и простым в выполнении методом обнаружения обратимой липидной модификации остатков цистеина (S-acylation) в различных биологических образцах.
Abstract
Белок S-ациляция, также называют S-palmitoylation, является обратимой пост-переводной модификации цистеина остатков с длинноцепочечными жирными кислотами через лабильное тиоэфирное крепление. S-ациляция, которая становится широко распространенным регулирующим механизмом, может модулировать почти все аспекты биологической активности белков, от комплексного образования до торговли белками и стабильности белка. Недавний прогресс в понимании биологической функции белка S-acylation был достигнут в значительной степени благодаря разработке новых биохимических инструментов, позволяющих надежно и чувствительное обнаружение белка S-ацилирования в различных биологических образцах. Здесь мы описываем ацил-ресинуажный захват (Acyl-RAC), недавно разработанный метод, основанный на селективном улавливании эндогенно S-ацилатированных белков тиол-реактивными бусинами сефарозы. По сравнению с существующими подходами, Acyl-RAC требует меньше шагов и может дать более надежные результаты в сочетании с масс-спектрометрией для идентификации новых целей S-acylation. Основным ограничением в этой технике является отсутствие способности различать виды жирных кислот, прикрепленных к цистеинам через ту же связь тиостера.
Introduction
S-ациляция является обратимой пост-трансляционной модификации с участием добавления жировой цепи ацила к внутренним остаткам цистеина на целевой белок через лабильный тиоэфир облигации1. Впервые сообщалось, как модификация белков с palmitate, насыщенных 16-углеродной жирной кислоты2, и поэтому эта модификация часто называют S-palmitoylation. В дополнение к пальмитату, белки могут быть обратимы различными более длинными и короткими насыщенными (миристейстом и стеатом), мононенасыщенными (олеатом) и полиненасыщенными (арачидонаинат и эйкозапентановат) жирными кислотами3,,4,5,,6,,7. В эукариотических клетках, S-ацилирование является катализатором семьи ферментов, известных как DHHC белка ацилтрансферазы и обратная реакция цистеина деакилиации является катализируется белка thioesterases, большинство из которых до сих пор остаются загадочными8.
Lability связи тиоэстера делает эту липидную модификацию обратимой, позволяя ей динамически регулировать кластеризацию белков, локализацию плазменной мембраны, внутриклеточный оборот, белково-белковые взаимодействия и стабильность белка9,10. Следовательно, S-акилирование было связано с несколькими расстройствами, включая болезнь Гентингтона, болезнь Альцгеймера и несколько видов рака (простата, желудок, мочевой пузырь, легкие, колоректальные), что требует разработки надежных методов для обнаружения этого пост-переводного белка модификации11.
Метаболическая маркировка с радиоактивным (No3H,14C) или125Я) palmitate был одним из первых подходов, разработанных для проверки белка S-ацилинг12,13,14. Тем не менее, радиомаркировка на основе методов настоящее здоровье проблем, не очень чувствительны, отнимает много времени, и только обнаружить липидацию очень обильные белки15. Быстрее и нерадиоактивной альтернативой радиомаркировке является метаболическая маркировка биоортогональными жирными кислотными зондами, которые регулярно используются для проверки динамики белка S-acylation16. В этом методе, жирные кислоты с химическим репортером (алкин или азид группы) включена в S-ацилатированный белок белка ацилтрансферазы. Азидея-алкин huisgen циклоaddition реакции (нажмите химии) может быть использован для присоединения функционализованной группы, такие как фторофор или биотин, к интегрированной жирной кислоты, что позволяет для обнаружения S-ацилатированный белок17,18,19.
Ацил-биотин обмен (ABE) является одним из широко используемых биохимических методов для захвата и идентификации S-ацилатных белков, что обходит некоторые недостатки метаболической маркировки, такие как непригодность для образцов тканей15. Этот метод может быть применен для анализа S-ациляции в различных биологических образцов, в том числе тканей и замороженных образцов клеток20,21. Этот метод основан на селективном расщеплении тиоэстерной связи между ациловой группой и остатками цистеина нейтральным гидроксиламином. Освобожденные группы тиола затем захватываются с тиол-реактивной производной биотина. Генерируемые биоинтинилапотированные белки затем сродство очищается с помощью стрептавидина агарозы и анализируются с помощью иммуноблоттинга.
Альтернативный подход называется acyl-resin помощь захвата (Acyl-RAC) был позже введен, чтобы заменить биотинилационный шаг с прямым спряжением свободных цистеинов тиол-реактивного ресина22,23. Этот метод имеет меньше шагов по сравнению с ABE и аналогичным образом может быть использован для обнаружения белка S-ациляции в широком диапазоне образцов1.
Acyl-RAC состоит из 4 основных ступеней(рисунок 1),
1. Блокирование свободных групп тиола;
2. Селективное расщепление цистеино-ациловый тиоэстер связи с нейтральным гидроксиламином (HAM) для разоблачения цистеина тиол групп;
3. Захват липидных цистеинов с тиол-реактивным ресином;
4. Избирательное обогащение S-ацилатированных белков после elution с уменьшением буфера.
Захваченные белки могут быть проанализированы с помощью иммуноблоттинга или подвергнуты массовой спектрометрии (MS) на основе протеомики для оценки S-ацилата протеома в различных видов и тканей22,24,25. Индивидуальные s-ацилирования сайты также могут быть определены путем трипсина переваривания захваченных белков и анализа в результате пептиды LC-MS/MS22. Здесь мы демонстрируем, как ацил-РАК может быть использован для одновременного обнаружения S-ацилирования нескольких белков как в клеточной линии, так и в образце ткани.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы успешно использовали ацил-RAC анализ для обнаружения S-ацилирования отдельных белков как в культивированных человеческих клеток и первичных клеток, полученных из ткани мыши. Этот метод прост, чувствителен и может быть легко выполнен с минимальными требованиями к оборудованию с…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения грантов 5R01GM115446 и 1R01GM130840.
Materials
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets | Sigma | 11836170001 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620444 | |
| Hydroxylamine (HAM) | Sigma | 159417 | |
| Methyl methanethiosulfonate (MMTS) | Sigma | 64306 | |
| Mini tube rotator | LabForce | ||
| ML211 | Cayman | 17630 | |
| Multi-Therm Cool-Heat-Shake | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) | Sigma | D641 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) | Sigma | T8387 | |
| Ultrasonics Quantrex Sonicator | L & R |
References
- Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).
- Magee, A. I., Courtneidge, S. A. Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells. EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).
- Fujimoto, T., et al. P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage. Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).
- DeMar, J. C., Anderson, R. E. Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver. Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).
- Montigny, C., et al. S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin. Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).
- Muszbek, L., Laposata, M. Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets. Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).
- Hallak, H., et al. Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).
- Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. Discovery of protein-palmitoylating enzymes. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. , 1206 (2008).
- Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids. Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).
- Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck. Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).
- Blanc, M., et al. SwissPalm: Protein Palmitoylation database. F1000Research. 4, 1-23 (2015).
- O’Brien, P. J., Zatz, M. Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid. Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).
- Drahansky, M., et al. We are IntechOpen , the world’s leading publisher of Open Access books Built by scientists. Intech. 13, (2016).
- Resh, M. D. Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation. Methods. 40 (2), 191-197 (2006).
- Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).
- Martin, B. R., Cravatt, B. F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells. Nature Methods. 6, 135-138 (2009).
- Rami, N., Hannoush, N. A. -. R. Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins. ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).
- Kostiuk, M. A., et al. Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue. FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).
- Charron, G., et al. Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters. Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).
- Roth, A. F., et al. Global analysis of protein palmitoylation in yeast. Cell. 125, 1003-1013 (2006).
- Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).
- Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
- Guo, J., et al. Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
- Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).
- Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and activation of murine lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).
- Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative “null” and “T” cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).
- Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).
- Hundt, M., et al. Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells. Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).
- Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).
- Brdicka, T., et al. Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation. Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).
- Akimzhanov, A. M., Boehning, D. Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).
- Stetsenko, A., Guskov, A. An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7 (7), (2017).
- Adibekian, A., et al. Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2). Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).
- Dekker, F. J., et al. Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling. Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).
- Zhou, B., et al. Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis. Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).
