Проверка секвенирования всего генома нанопор, использование вируса Усуту в качестве примера
Summary
Ранее мы утвердили протокол для ампрона на основе всего генома usutu вируса (USUV) секвенирования на нанопор секвенирования платформы. Здесь мы описываем методы, используемые более подробно, и определяем частоту ошибок ячейки потока nanopore R10.
Abstract
Полное секвенирование генома может быть использовано для характеристики и отслеживания вирусных вспышек. Нанопор основе всего генома секвенирования протоколы были описаны для нескольких различных вирусов. Эти подходы используют перекрывающийся подход на основе ампрона, который может быть использован для целевой конкретной цели вируса или группы генетически связанных вирусов. В дополнение к подтверждению присутствия вируса, секвенирование может быть использовано для исследований геномной эпидемиологии, для отслеживания вирусов и распутывания происхождения, резервуаров и способов передачи. Для таких приложений крайне важно понять возможные последствия ошибки, связанные с используемой платформой. Регулярное применение в клинических и медицинских учреждениях требует, чтобы это было задокументировано с каждым важным изменением протокола. Ранее протокол для секвенирования вируса Усуту на платформе секвенирования нанопор был проверен (R9.4 flowcell) путем прямого сравнения с секвенированием Illumina. Здесь мы описываем метод, используемый для определения требуемого покрытия чтения, используя в качестве примера сравнение между ячейкой потока R10 и секвенированием Illumina.
Introduction
Быстрые разработки технологий последовательности третьего поколения позволяют нам двигаться вперед к непосредственному к реальному времени секвенированию во время вирусных вспышек. Эта своевременная доступность генетической информации может быть полезна для определения происхождения и эволюции вирусных патогенов. Золотые стандарты в области последовательности следующего поколения, однако, по-прежнему второго поколения секвенсоров. Эти методы опираются на конкретные и трудоемкие методы, такие как клональное усиление во время эмульсии ПЦР или клонального усиления моста. Секвенсоры третьего поколения дешевле, ручные и поставляются с упрощенными методологиями подготовки библиотеки. Особенно небольшой размер устройства последовательности и низкая цена покупки делает его интересным кандидатом для развертывания, полевых секвенирования. Это можно было, например, увидеть во время вспышки вируса Эбола в Сьерра-Леоне и во время продолжающихся исследований вспышки арбовируса в Бразилии1,2,3. Однако заявленный высокий уровень ошибок4 может ограничить приложения, для которых можно использовать секвенирование нанопор.
Секвенирование Nanopore быстро развивается. Новые продукты доступны на рынке на регулярной основе. Примерами этого являются, например, 1D квадратный наборы, которые позволяют секвенировать обе нити молекулы ДНК, тем самым повышая точность называется баз5 и развитие R10 поток овой клетки, которая измеряет изменения в токе в двух различных случаях в поре6. Кроме того, усовершенствованные биоинформатические инструменты, такие как усовершенствования в basecalling, повысят точность бейс-звонка7. Один из наиболее часто используемых бейскалькеров (например, Albacore) обновлялся по крайней мере 12 раз за 9-месячный период5. Недавно производитель также выпустил новый базовый под названием flip-flop, который реализован в программном обеспечении нанопор по умолчанию8. Вместе все эти улучшения приведут к более точным последовательности и уменьшит частоту ошибок нанопор секвенсора.
Вирус Усуту (USUV) является арбовирусом, передаваемым комарами семейства Flaviviridae, и он имеет положительно-stranded геном РНК около 11000 нуклеотидов. USUV в основном влияет на большие серые совы и черные дроздов9,10, хотя другие виды птиц также восприимчивы к USUV инфекции11. Недавно USUV был также выявлен у грызунов и землеройки, хотя их потенциальная роль в передаче вируса остается неизвестной12. У людей, бессимптомные инфекции были описаны в донорах крови13,14,15,16 в то время как USUV инфекций также сообщалось, связанные с энцефалитом или менинго-энцефалит17,18. В Нидерландах USUV впервые был обнаружен у диких птиц в 2016году 10 и в бессимптомных донорах крови в 2018году 14. С момента первоначального обнаружения USUV, вспышки были зарегистрированы в течение последующих лет и эпиднадзора, в том числе весь секвенирование генома, в настоящее время продолжается для мониторинга появления и распространения арбовируса в ранее наивной популяции.
Подобно тому, что было описано для других вирусов, таких как вирус Эбола, вирус Зика и вирус желтой лихорадки3,19,20, мы разработали грунтовку набор для последовательности полной длины USUV21. Этот подход на основе полимеразы цепи (PcR) позволяет восстановить полноформатные геномы USUV из сильно загрязненных хост-типов образцов, таких как образцы мозга в образцах до значения Ct около 32. Преимуществам подхода к секвенированию на основе амприкона являются более высокая чувствительность по сравнению с метагеномным секвенированием и более высокая специфичность. Ограничения использования ампронов основе подхода в том, что последовательности должны быть аналогичными для того, чтобы разработать грунтовки установки всех штаммов и что праймеры разработаны на наших нынешних знаний о разнообразии вирусов.
Учитывая постоянные разработки и улучшения в последовательности третьего поколения, необходимо регулярно оценивать частоту ошибок секвенсора. Здесь мы описываем метод оценки производительности нанопор непосредственно против последовательности Illumina с использованием USUV в качестве примера. Этот метод применяется к последовательностям, генерируемым с последней ячейкой потока R10, и базовый вызов выполняется с последней версией флип-флопа basecaller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Секвенирование Nanopore постоянно развивается, и поэтому существует необходимость в методах мониторинга частоты ошибок. Здесь мы описываем рабочий процесс для мониторинга частоты ошибок нанопор секвенсора. Это может быть полезно после выпуска новой ячейки потока, или если новые релизы basecalling выпущены. Однако это также может быть полезно для пользователей, которые хотят настроить и проверить свой собственный протокол последовательности.
Различные программы и инструменты выравнивания могут дать различные результаты33. В этой рукописи мы стремились использовать свободно доступные пакеты программного обеспечения, которые широко используются и которые имеют четкую документацию. В некоторых случаях предпочтение может отдаваться коммерческим инструментам, которые, как правило, имеют более удобные интерфейсы, но должны быть оплачены. В будущем, этот метод может быть применен к той же выборке в случае, если большие изменения в технологии последовательности или basecalling программного обеспечения вводятся Предпочтительно это должно быть сделано после каждого обновления basecaller или flowcell, однако, учитывая скорость текущих событий это также может быть сделано только после крупных обновлений.
Снижение частоты ошибок в секвенировании позволяет мультиплексировать большее число образцов. Таким образом, секвенирование нанопор приближается к замене обычных ПЦР в реальном времени для диагностических анализов, что уже имеет место в случае диагностики вируса гриппа. Кроме того, снижение частоты ошибок повышает удобство секвенирования этого метода, например для определения незначительных вариантов и для высокой пропускной способности беспристрастного метагеномического секвенирования.
Важным шагом в протоколе является наличие близких и надежных эталонных последовательностей. Праймеры основаны на текущих знаниях о разнообразии вирусов и, возможно, должны обновляться каждый раз в то время. Другим критическим моментом при настройке подхода к секвенированию на основе амприкона является балансирование концентрации грунтовки, чтобы получить ровный баланс в глубине ампрона. Это позволяет мультиплексировать больше образцов на последовательности запуска и приводит к значительному сокращению затрат.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа получила финансирование от научно-исследовательской и инновационной программы Европейского союза «Горизонт 2020» в соответствии с соглашением о предоставлении грантов No 643476 (COMPARE).
Materials
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| dNTPs | Qiagen | 201900 | |
| FLO-MIN106 R10 flowcell | Nanopore | R10 flowcell | |
| KAPA Hyperplus libarary preparation kit | Roche | 7962436001 | |
| Library Loading Bead Kit | Nanopore | EXP-LLB001 | |
| Ligation Sequencing Kit 1D | Nanopore | SQK-LSK109 | |
| Native Barcoding Kit 1D 1-12 | Nanopore | EXP-NBD103 | |
| Native Barcoding Kit 1D 13-24 | Nanopore | EXP-NBD104 | |
| NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | NEB | M0367S | |
| NEB Next Quick Ligation Module | NEB | E6056 | |
| NEB Next Ultra II End Repair / dA-Tailing Module | NEB | E7546S | |
| Protoscript II Reverse Transcriptase | NEB | M0368X | |
| Q5 High-Fidelity polymerase | NEB | M0491 | |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | |
| RNAsin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 |
References
- Faria, N. R., et al. Establishment and cryptic transmission of Zika virus in Brazil and the Americas. Nature. 546 (7658), 406-410 (2017).
- Bonaldo, M. C., et al. Genome analysis of yellow fever virus of the ongoing outbreak in Brazil reveals polymorphisms. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (6), 447-451 (2017).
- Faria, N. R., et al. Genomic and epidemiological monitoring of yellow fever virus transmission potential. bioRxiv. , 299842 (2018).
- Magi, A., Giusti, B., Tattini, L. Characterization of MinION nanopore data for resequencing analyses. Briefings in Bioinformatics. 18 (6), bbw077 (2016).
- Rang, F. J., Kloosterman, W. P., de Ridder, J. From squiggle to basepair: computational approaches for improving nanopore sequencing read accuracy. Genome Biology. 19 (1), 90 (2018).
- . Nanopore Store, R10 flow cells Available from: https://store.nanoporetech.com/flowcells/spoton-flow-cell-mk-i-r10.html (2019)
- Wick, R. R., Judd, L. M., Holt, K. E. Performance of neural network basecalling tools for Oxford Nanopore sequencing. Genome Biology. 20 (1), 129 (2019).
- . GitHub – nanoporetech/flappie: Flip-flop basecaller for Oxford Nanopore reads Available from: https://github.com/nanoporetech/flappie (2019)
- Lühken, R., et al. Distribution of Usutu Virus in Germany and Its Effect on Breeding Bird Populations. Emerging Infectious Diseases. 23 (12), 1994-2001 (2017).
- Cadar, D., et al. Widespread activity of multiple lineages of Usutu virus, Western Europe, 2016. Eurosurveillance. 22 (4), (2017).
- Becker, N., et al. Epizootic emergence of Usutu virus in wild and captive birds in Germany. PLoS ONE. 7 (2), (2012).
- Diagne, M., et al. Usutu Virus Isolated from Rodents in Senegal. Viruses. 11 (2), 181 (2019).
- Bakonyi, T., et al. Usutu virus infections among blood donors, Austria, July and August 2017 – Raising awareness for diagnostic challenges. Eurosurveillance. 22 (41), (2017).
- Zaaijer, H. L., Slot, E., Molier, M., Reusken, C. B. E. M., Koppelman, M. H. G. M. Usutu virus infection in Dutch blood donors. Transfusion. , trf.15444 (2019).
- Cadar, D., et al. Blood donor screening for West Nile virus (WNV) revealed acute Usutu virus (USUV) infection, Germany, September 2016. Eurosurveillance. 22 (14), 30501 (2017).
- Pierro, A., et al. Detection of specific antibodies against West Nile and Usutu viruses in healthy blood donors in northern Italy, 2010–2011. Clinical Microbiology and Infection. 19 (10), E451-E453 (2013).
- Pecorari, M., et al. First human case of Usutu virus neuroinvasive infection, Italy, August-September 2009. Euro surveillance: bulletin européen sur les maladies transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 14 (50), (2009).
- Simonin, Y., et al. Human Usutu Virus Infection with Atypical Neurologic Presentation, Montpellier, France, 2016. Emerging Infectious Diseases. 24 (5), 875-878 (2018).
- Quick, J., et al. Multiplex PCR method for MinION and Illumina sequencing of Zika and other virus genomes directly from clinical samples. Nature Protocols. 12 (6), 1261-1276 (2017).
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).
- Oude Munnink, B. B., et al. Towards high quality real-time whole genome sequencing during outbreaks using Usutu virus as example. Infection, Genetics and Evolution. 73, 49-54 (2019).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W. GenBank. Nucleic Acids Research. 38 (Database issue), D46-D51 (2010).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research. 32 (5), 1792-1797 (2004).
- . GitHub – rrwick/Porechop: adapter trimmer for Oxford Nanopore reads Available from: https://github.com/rrwick/porechop (2018)
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
- Li, H. Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics. 34 (18), 3094-3100 (2018).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics (Oxford, England). 30 (15), 2114-2120 (2014).
- . BBMap download | SourceForge.net Available from: https://sourceforge.net/projects/bbmap/ (2019)
- Bankevich, A., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).
- Clausen, P. T. L. C., Aarestrup, F. M., Lund, O. Rapid and precise alignment of raw reads against redundant databases with KMA. BMC Bioinformatics. 19 (1), 307 (2018).
- Brinkmann, A., et al. Proficiency Testing of Virus Diagnostics Based on Bioinformatics Analysis of Simulated In Silico High-Throughput Sequencing Data Sets. Journal of Clinical Microbiology. 57 (8), (2019).
