Validando o sequenciamento de nanoporos de genoma inteiro, usando o vírus Usutu como exemplo

NOTA: Lista de ferramentas de software a serem utilizadas: usearch v11.0.667; músculo v3.8.1551; porechop 0.2.4; cutadapt 2.5; minimap2 2.16-r922; samtools 1.9; trimmomatic 0,39; bbmap 38.33; espadas v3.13.1; kma-1.2.8 1. Design de primer Comece com o download ou recuperação de um conjunto de seqüências de genoma suscitadas de referência relevantes de coleções de dados públicas ou privadas. Por exemplo, recupere todos os genomas USUV de comprimento total (taxid64286) do banco de dados NCBI22. USUV codifica um genoma de cerca de 11.000 nucleotídeos, então só recupere as seqüências com um comprimento de seqüência de 8.000-12.000 nucleotídeos. Faça isso usando a seguinte entrada de pesquisa:- taxid64286[Organism:noexp] E 8000[SLEN]:12000[SLEN]. Clique em Enviar para | Registro completo | Arquivo; usar formato = FASTA e criar o Arquivo. Para reduzir o tamanho do conjunto de seqüências de referência, remova seqüências duplicadas ou seqüências com mais de 99% de identidade de nucleotídeos do conjunto de dados. Faça isso usando a opção cluster fast do usearch23. Na linha de comando digite:- usearch -cluster_fast All_USUV.fasta -id 0,99 -centroids All_USUV_dedup.fasta Para gerar os primers, as sequências precisam ser alinhadas. Isso é feito usando MUSCLE24. Na linha de comando digite:- músculo -em All_USUV_dedup.fasta -out All_USUV_dedup_aligned.fasta -log log_muscle.txtNOTA: É essencial inspecionar manualmente o alinhamento para verificar se há discrepâncias. Estes podem ser corrigidos manualmente se necessário e as extremidades podem ser aparadas de acordo com o comprimento da maioria das seqüências de genoma inteiros. Primal é usado para fazer uma seleção de rascunho dos primers que podem ser usados para seqüência de amplicon de comprimento total19. Carregue o alinhamento para o site primitivo(http://primal.zibraproject.org/)e selecione o comprimento de amplicon preferido e sobreponha o comprimento entre os diferentes amplicons. Vá para primal.zibraproject.org, preencha o nome Esquema,carregue o arquivo fasta alinhado, selecione o comprimento do amplicon, sobreponha o tamanho e gere o esquema. Alinhe o conjunto completo de seqüências USUV completas disponíveis (não o conjunto reduzido ou deduplicado). Na linha de comando digite:- músculo -em All_USUV.fasta -out All_USUV_aligned.fasta -log log_muscle.txtNOTA: Mapeie os primers gerados contra o alinhamento completo (não use o alinhamento duplicado), corrija manualmente erros e inclua um máximo de 5 posições degenerativas de primer. 2. Multiplex PCR Execute o MULTIPLEX PCR usando os primers projetados e sequenciamento de nanoporos e Illumina. O PCR multiplex para USUV foi realizado como descritoanteriormente 19,21. Execute a chamada base com a versão 3.0.6.6+9999d81. 3. Análise de dados para gerar seqüências de consenso a partir de dados de nanoporos Várias amostras podem ser multiplexadas em uma única seqüência de nanoporos. Depois de executar a sequência de execução, demultiplexe os dados de nanoporos. Use Porechop25 para isso. Para evitar contaminação e aumentar a precisão, utilize a bandeira require_two_barcodes. Na linha de comando digite:- porechop -i Run_USUV.fastq -o Run_USUV_demultiplex –require_two_barcodes Após desmultiplexação, remova seqüências de primer (indicadas no arquivo Primers_Usutu.fasta em ambas as orientações) usando cutadapt26. Além disso, remova sequências com um comprimento menor que 75 nucleotídeos. Os primers devem ser removidos, pois podem introduzir vieses artificiais na seqüência de consenso. Na linha de comando digite:- cutadapt -b arquivo:Primers_USUV.fasta -o BC01_trimmed.fastq BC01.fastq -m 75 As leituras de seqüência demultiplexadas podem ser mapeadas contra um painel de diferentes cepas de referência usando minimap227 e uma seqüência de consenso pode ser gerada usando samtools28. Siga o exemplo abaixo que mostra o procedimento de um alinhamento baseado em referência e a geração de seqüência de consenso de uma amostra: BC01. Na linha de comando digite:- minimap2 -ax map-ont Random_Refs_USUV.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01.bam- samtools classificar BC01.bam > BC01_sorted.bam- bcftools mpileup -Ou -f Random_Refs_USUV.fasta BC01_sorted.bam | bcftools call -mv -Oz -o BC01.vcf.gz- bcftools índice BC01.vcf.gz- gato Random_Refs_USUV.fasta | bcftools consenso BC01.vcf.gz > BC01_consensus.fasta Para alinhamentos baseados em referência, é essencial que uma seqüência de referência intimamente relacionada seja usada. Portanto, realize uma pesquisa BlastN com a seqüência de consenso gerada para identificar a cepa de referência mais próxima. Depois disso, repita o alinhamento baseado em referência com a linha gemida de referência mais próxima como referência (etapa 3.3 e 3.4). Na linha de comando digite:- minimap2 -ax map-ont Ref_USUV_BC01.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01_ref.bam- samtools classificar BC01_ref.bam > BC01_sorted_ref.bam- bcftools mpileup -Ou -f Ref_USUV_BC01.fasta BC01_sorted_ref.bam | bcftools call -mv -Oz -o BC01_ref.vcf.gz- índice bcftools BC01_ref.vcf.gz- gato Ref_USUV_BC01.fasta | consenso bcftools BC01_ref.vcf.gz > BC01_ref_consensus.fasta 4. Análise dos dados da Illumina Essas seqüências são automaticamente demultiplexadas após o sequenciamento. As leituras podem ser controladas pela qualidade usando trimmomatic29. Para seqüências de Illumina de extremidade emparelhada, use a pontuação mediana de phred de corte comumente usada de 33 e um comprimento mínimo de leitura de 75 para obter leituras precisas e de alta qualidade. Na linha de comando digite:- trimmomatic PE -phred33 9_S9_L001_R1_001.fastq.gz 9_S9_L001_R2_001.fastq.gz 9_1P.fastq 9_1U.fastq 9_2P.fastq 9_2U.fastq LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:3 MINLEN:75 Remova os primers (indicados no arquivo Primers_Usutu.fasta em ambas as orientações), pois eles podem introduzir vieses artificiais, usando cutadapt26. Além disso, remova seqüências com um comprimento menor que 75 nucleotídeos usando os comandos abaixo. Na linha de comando digite:- cutadapt -b o 9_1P_trimmed.fastq -p 9_2P_trimmed.fastq 9_1P.fastq 9_2P.fastq -m 75 Antes da montagem de novo, as leituras da seqüência podem ser normalizadas para uma cobertura uniforme em todo o genoma. Isso é essencial, pois montadoras de novo como SPAdes levam em conta a cobertura de leitura ao montar leituras de seqüência. Normalizar leituras para uma cobertura de leitura de 50 usando BBNorm do pacote BBMap30. Na linha de comando digite:- bbmap/bbnorm.sh target=50 in=9_1P_trimmed.fastq in2=9_2P_trimmed.fastq out=Sample9_FW_norm.fastq out2=Sample9_RE_norm.fastq As leituras normalizadas são montadas de novo usando SPAdes31. As configurações padrão são usadas para o conjunto usando todos os kmers diferentes (21, 33, 55, 77, 99 e 127). Na linha de comando digite:- spades.py -k 21,33,55,77,99,127 -o Amostra9 -1 Amostra9.qc.f.fq -2 Sample9.qc.r.fq Mapeie o QC lê contra a seqüência de consenso obtida usando minimap2 e programas como Geneious, Bioedit ou Ugene para fazer a curadoria do alinhamento. É importante verificar o início e o fim do contig. Alinhar as leituras do QC contra o sequenciamento de consenso obtido usando minimap2. Importe o alinhamento em Geneious/Bioedit/UGene. Inspecione manualmente, corrija e faça a curadoria especialmente o início e o fim do genoma. 5. Determinar a cobertura de leitura necessária para compensar o perfil de erro no sequenciamento de nanoporos usando dados de Illumina como padrão-ouro Selecionar seqüência lê mapeamento para um amplicon, neste caso amplicon 26. Posteriormente, mapeie as leituras de nanoporos contra este amplicon usando minimap2. Use samtools para selecionar apenas o mapeamento de leituras para amplicon 26 e converter o arquivo bam em fastq. Na linha de comando digite:- minimap2 -ax map-ont -m 150 Amplicon26.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01.bam- samtools view -b -F 4 BC01.bam > BC01_mapped.bam- samtools bam2fq BC01_mapped.bam | seqtk seq – -> BC01_mapped.fastq Selecionar aleatoriamente subconjuntos de, por exemplo, 200 sequências lê mil vezes. Por exemplo, alterá-lo para 10 resultará na seleção aleatória de mil vezes um subconjunto de 10 leituras de seqüência. O script é fornecido como Arquivo Suplementar 1. Na linha de comando digite:- python Random_selection.py Todas as leituras de seqüência selecionadas aleatoriamente estão alinhadas ao amplicon 26. Use KMA32 para mapear as leituras da seqüência e gerar imediatamente uma seqüência de consenso. Use configurações otimizadas para sequenciamento de nanoporos, indicada pela bandeira -bcNano. Na linha de comando digite:- índice kma -i Amplicon26.fasta- para arquivo em random_sample*;- sampleID=${file%.fastq}- kma -i ${sampleID}.fastq -o ${sampleID} -t_db Amplicon26.fasta -mem_mode -mp 5 -mrs 0.0 -bcNano- feito Inspecione as seqüências de consenso geradas na linha de comando usando:- gato *.fsa > All_genomes.fsa- minimap2 -ax map-ont Amplicon26.fasta All_genomes.fsa > All_genomes.bam- samtools tipo All_genomes.bam > All_genomes_sorted.bam- estatísticas de samtools All_genomes_sorted.bam > stats.txt A taxa de erro é exibida no stats.txt a taxa de erro de título #mismatches / bases mapeadas. Exiba-o na tela com o seguinte comando:- grep ^SN stats.txt | corte -f 2- A quantidade de indels é exibida a posição #Indels por ciclo. Exiba-o na tela com o seguinte comando:- grep ^IC stats.txt | corte -f 2-