全ゲノムナノポアシーケンシングの検証、例としてUsutuウイルスを用いた

注: 使用するソフトウェア ツールの一覧: usearch v11.0.667;筋肉 v3.8.1551;ポレチョップ 0.2.4;カットアダプト2.5;ミニマップ2 2.16-r922;サムツール 1.9;トリミング 0.39;bbmap 38.33;スペード v3.13.1;kma-1.2.8 1. プライマー設計 まず、パブリックまたはプライベートデータコレクションから関連する参照全ゲノム配列のセットをダウンロードまたは取得します。たとえば、NCBI データベース22から全長 USUV ゲノム (taxid64286) を取得します。USUVは約11,000ヌクレオチドのゲノムをコードするので、配列長が8,000〜12,000ヌクレオチドの配列のみを取り出す。次の検索エントリを使用して、これを行います。-タクシー64286[生物:noexp]と8000[SLEN]:12000[SLEN]。 [送信] をクリックします。 |完全な記録 |ファイル;フォーマット = FASTA を使用して、ファイルを作成します。 参照配列のセットを縮小するには、データセットから 99% 以上のヌクレオチド ID を持つ重複した配列またはシーケンスを削除します。usearch23のクラスター高速オプションを使用して、これを行います。コマンド ラインで次のように入力します。- usearch -cluster_fast All_USUV.fasta -id 0.99 – All_USUV_dedup プライマーを生成するには、配列を整列させる必要があります。これはMUSCLE24を使用して行われます。コマンド ラインで次のように入力します。-筋肉 – All_USUV_dedup.fasta -out All_USUV_dedup_aligned.fasta -ログlog_muscle.txt注: 位置合わせを手動で検査して、不一致を確認することが重要です。これらは必要に応じて手動で修正することができ、端部はほとんどの全ゲノム配列の長さに従ってトリミングすることができる。 プライマルは、フルレンポンシーケンシング19に使用できるプライマーのドラフト選択を行うために使用されます。ライメントを原始ウェブサイト(http://primal.zibraproject.org/)にアップロードし、異なるアンプリコン間の好ましいアンプリコンの長さと重なりの長さを選択します。primal.zibraproject.orgに移動し、スキーム名を入力し、整列したfastaファイルをアップロードし、アンプリコンの長さ、オーバーラップサイズを選択し、スキームを生成します。 使用可能な完全な USUV シーケンスの完全なセットを揃えます (ダウンサイズまたは重複除去されたセットではありません)。コマンド ラインで次のように入力します。-筋肉 – All_USUV.fasta -out All_USUV_aligned.fasta -log log_muscle.txt注:生成されたプライマーを完全なアライメント(重複除去アライメントを使用しない)にマップし、手動でエラーを修正し、最大5つの変性プライマー位置を含めます。 2. マルチプレックス PCR 設計されたプライマーとナノポアとイルミナシーケンシングを使用してマルチプレックスPCRを実行します。USUV用のマルチプレックスPCRは、前述の19,21,と同様に行った。 フリップフロップバージョン3.0.6.6+9999d81でベースコールを実行します。 3. ナノポアデータからコンセンサス配列を生成するデータ解析 複数のサンプルを単一のナノポアシーケンシング実行で多重化できます。シーケンス実行を行った後、ナノポアデータをデマルチプレックス化する。このためにポレチョップ25を使用してください。汚染を防止し、精度を高めるために、require_two_barcodesフラグを使用します。コマンド ラインで次のように入力します。-ポレチョップ -i Run_USUV.fastq -o Run_USUV_demultiplex –require_two_barcodes デマルチプレクシングの後、cutadapt26を使用してプライマー シーケンス (両方の向きでファイル Primers_Usutu.fasta に示されている) を削除します。さらに、75ヌクレオチドより短い長さの配列を除去する。プライマーは、コンセンサスシーケンスに人工バイアスを導入できるため、除去する必要があります。コマンド ラインで次のように入力します。-カットアダプト -b ファイル:Primers_USUV.fasta -o BC01_trimmed.fastq BC01.fastq -m 75 デマルチプレックスシーケンス読み取りは、minimap227を使用して別個の基準歪みのパネルにマッピングすることができ、samtools28を使用してコンセンサスシーケンスを生成することができます。以下の例に従って、参照ベースのアライメントの手順と、1 つのサンプルのコンセンサスシーケンス生成 BC01 を示します。コマンド ラインで次のように入力します。-ミニマップ2 -axマップオンRandom_Refs_USUV.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01.bam-サムツールソートBC01.bam > BC01_sorted.bam- bcftools mpileup -Ou -f Random_Refs_USUV.fasta BC01_sorted.bam | bcftools コール -mv -Oz -o BC01.vcf.gz- bcfツールインデックス BC01.vcf.gz-猫Random_Refs_USUV.fasta | bcftoolsコンセンサス BC01.vcf.gz > BC01_consensus.fasta 参照ベースの配置では、密接に関連する参照シーケンスを使用することが不可欠です。したがって、生成されたコンセンサスシーケンスを使用して BlastN 検索を実行し、最も近い参照株を特定します。その後、参照に最も近い参照ひずみで参照ベースの位置合わせを繰り返します(ステップ 3.3 および 3.4)。コマンド ラインで次のように入力します。-ミニマップ2 -axマップオントRef_USUV_BC01.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01_ref.bam-サムツールソートBC01_ref.bam > BC01_sorted_ref.bam- bcftools mpileup -Ou -f Ref_USUV_BC01.ファタ BC01_sorted_ref.bam | bcftools コール -mv -Oz -o BC01_ref.vcf.gz- bcftools インデックス BC01_ref.vcf.gz-猫 Ref_USUV_BC01.fasta | bcftools コンセンサス BC01_ref.vcf.gz > BC01_ref_consensus.fasta 4. イルミナデータの解析 これらのシーケンスは、シーケンス後に自動的に多重化解除されます。読み取りは、trimmomatic29を使用して品質管理できます。ペアエンドイルミナシーケンスの場合、正確で高品質の読み取りを得るために、一般的に使用されるカットオフ中央値PHREDスコア33と75の最小読み取り長さを使用します。コマンド ラインで次のように入力します。-トリミング PE -phred33 9_S9_L001_R1_001.fastq.gz 9_S9_L001_R2_001.fastq.gz 9_1P.fastq 9_1U.fastq 9_2P.fastq 9_2U.fastq リーディング:3 トレーリング:3 スライディングウィンドウ:3:15 ミンレン:75 彼らは、カットアダプト26を使用して、人工的バイアスを導入することができるので、プライマー(両方の向きでPrimers_Usutu.fastaに示されている)を除去します。さらに、以下のコマンドを使用して、75ヌクレオチドより短い長さの配列を除去する。コマンド ラインで次のように入力します。-カットアダプト -b o 9_1P_trimmed.fastq -p 9_2P_trimmed.fastq 9_1P.fastq 9_2P.fastq -m 75 デノボアセンブリの前に、配列読み取りはゲノム全体の均等なカバレッジのために正規化することができます。SpAdes のようなデノボ アセンブラーは、シーケンス読み取りを組み立てる際に読み取りカバレッジを考慮に入れるので、これは不可欠です。BBMapパッケージ30からBBNormを使用して50の読み取りカバレッジに読み取りを正規化します。コマンド ラインで次のように入力します。- bbmap/bbnorm.sh ターゲット=50 in=9_1P_trimmed.fastq in2=9_2P_trimmed.fastq out=Sample9_FW_norm.fastq out2=Sample9_RE_norm.fastq 正規化された読み取りは、SPAdes31を使用して組み立てられます。既定の設定は、すべての異なる kmers (21、33、55、77、99、および 127) を使用してアセンブリに使用されます。コマンド ラインで次のように入力します。- spades.py -k 21,33,55,77,99,127 -o Sample9 -1 Sample9.qc.fq -2 Sample9.qc.r.fq minimap2と、配列をキュレーションするGeneious、BioeditまたはUgeneのようなプログラムを使用して、取得したコンセンサスシーケンスに対してQCの読み取りをマッピングします。コンティグの開始と終了を確認することが重要です。 取得したコンセンサスシーケンスに対して、MINImap2 を使用して QC 読み取りを位置合わせします。 アライメントをジェネイス/バイオエディット/UGeneにインポートします。 手動で検査、修正し、特にゲノムの始まりと終わりをキュレーション。 5. イルミナデータをゴールドスタンダードとして使用するナノポアシーケンシングのエラープロファイルを補正するために必要な読み込みカバレッジを決定する 選択シーケンスは、1アンプリコン(この場合はアンプリコン26)へのマッピングを読み取る。続いて、minimap2を使用して、このアンプリコンに対してナノポア読み取りをマッピングする。Samtools を使用して、アンプリコン 26 への読み取りマッピングのみを選択し、bam ファイルを fastq に変換します。コマンド ラインで次のように入力します。-ミニマップ2 -axマップオン -m 150 アンプリコン26.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01.bam-サムツールビュー -b -F 4 BC01.bam > BC01_mapped.bam-サムツール bam2fq BC01_mapped.bam | seqtk seq – -> BC01_mapped.fastq インスタンス 200 シーケンスのサブセットをランダムに選択すると、1000 回読み取られます。たとえば、10 に変更すると、10 シーケンス読み取りのサブセットの 1000 倍のランダム選択が行われます。このスクリプトは、補足ファイル 1として提供されます。コマンド ラインで次のように入力します。-パイソンRandom_selection.py ランダムに選択されたシーケンス読み取りはすべて、アンプリコン26に整列される。KMA32を使用して、シーケンス読み取りをマップし、すぐにコンセンサス シーケンスを生成します。bcNano フラグで示される、ナノポアシーケンスの最適化された設定を使用します。コマンド ラインで次のように入力します。- kma インデックス -i アンプリコン26.ファスタ- random_sample*のファイルに対して-サンプル ID=${ファイル%.ファストq}- kma -i ${sampleID}.fastq -o ${sampleID} -t_db アンプリコン26.ファフタ -mem_mode -mp 5 -mrs 0.0 -bcNano-完了 次のコマンドを使用して、生成されたコンセンサス シーケンスをコマンド ラインで検査します。-猫 *.fsa > All_genomesfsa-ミニマップ2 -axマップオンアンプリコン26.fasta All_genomes.fsa > All_genomes.bam-サムツールソートAll_genomes.bam > All_genomes_sorted.bam-サムツール統計All_genomes_sorted.bam > stats.txt エラー率は、マッピングされた見出しエラー率の下の stats.txt #mismatches / ベースに表示されます。次のコマンドを使用して、画面に表示します。-グレップ ^SN stats.txt | カット -f 2- インデルの量は、サイクルごとの見出し#Indelsの下に表示されます。次のコマンドを使用して、画面に表示します。-グレップ ^IC stats.txt | カット -f 2-