We valideerden eerder een protocol voor op amplicon gebaseerde whole genome Usutu virus (USUV) sequencing op een nanopore sequencing platform. Hier beschrijven we de methoden die in meer detail worden gebruikt en bepalen we het foutenpercentage van de nanopore R10-stroomcel.
Hele genoomsequencing kan worden gebruikt om virale uitbraken te karakteriseren en te traceren. Nanopore-gebaseerde hele genoom sequencing protocollen zijn beschreven voor verschillende virussen. Deze benaderingen maken gebruik van een overlappende amplicon-gebaseerde aanpak die kan worden gebruikt om een specifiek virus of groep van genetisch gerelateerde virussen te richten. Naast de bevestiging van de aanwezigheid van het virus, sequencing kan worden gebruikt voor genomische epidemiologie studies, om virussen te volgen en te ontrafelen oorsprong, reservoirs en modi van transmissie. Voor dergelijke toepassingen is het van cruciaal belang om de mogelijke effecten van het foutenpercentage in verband met het gebruikte platform te begrijpen. Routinematige toepassing in klinische en volksgezondheidsinstellingen vereisen dat dit wordt gedocumenteerd met elke belangrijke wijziging in het protocol. Voorheen werd een protocol voor het hele genoom Usutu virus sequencing op het nanopore sequencing platform gevalideerd (R9.4 flowcell) door directe vergelijking met Illumina sequencing. Hier beschrijven we de methode die wordt gebruikt om de vereiste leesdekking te bepalen, met behulp van de vergelijking tussen de R10-stroomcel en Illumina-sequencing als voorbeeld.
Snelle ontwikkelingen in de derde generatie sequentietechnologieën stellen ons in staat om verder te gaan in de richting van bijna real-time sequencing tijdens virale uitbraken. Deze tijdige beschikbaarheid van genetische informatie kan nuttig zijn om de oorsprong en evolutie van virale ziekteverwekkers te bepalen. Gouden normen op het gebied van de volgende generatie sequencing echter, zijn nog steeds de tweede generatie sequencers. Deze technieken zijn afhankelijk van specifieke en tijdrovende technieken zoals kloonversterking tijdens een emulsie PCR of kloonbrugversterking. De derde generatie sequencers zijn goedkoper, met de hand gehouden en worden geleverd met vereenvoudigde bibliotheek voorbereiding methodologieën. Vooral de kleine omvang van het sequentieapparaat en de lage aanschafprijs maken het een interessante kandidaat voor inzetbare, fieldable sequencing. Dit kan bijvoorbeeld worden gezien tijdens de uitbraak van het ebolavirus in Sierra Leone en tijdens de lopende onderzoeken naar de uitbraak van het arbovirus in Brazilië1,2,3. Het gerapporteerde hoge foutenpercentage4 kan echter de toepassingen beperken waarvoor nanopore sequencing kan worden gebruikt.
Nanopore sequencing evolueert snel. Nieuwe producten zijn regelmatig op de markt verkrijgbaar. Voorbeelden hiervan zijn bijvoorbeeld de 1D kwadraatkits die het mogelijk maken om beide strengen van het DNA-molecuul te rangschikken, waardoor de nauwkeurigheid van de zogenaamde basen5 en de ontwikkeling van de R10-stroomcel worden versterkt die de verandering in stroom meet in twee verschillende gevallen in de porie6. Bovendien zullen verbeterde bio-informatica-instrumenten, zoals verbeteringen in basecalling, de nauwkeurigheid van basecallingverbeteren 7. Een van de meest gebruikte basecallers (bijvoorbeeld Albacore) is in eenperiodevan 9 maanden minstens 12 keer bijgewerkt. Onlangs heeft de fabrikant ook een nieuwe basecaller genaamd flip-flop, die wordt geïmplementeerd in de standaard nanopore software8. Samen zullen al deze verbeteringen leiden tot nauwkeurigere sequenties en zal het foutenpercentage van de nanoporie sequencer verminderen.
Usutu virus (USUV) is een mug-borne arbovirus van de familie Flaviviridae en het heeft een positief gestrande RNA genoom van ongeveer 11.000 nucleotiden. USUV treft vooral grote grijze uilen en merels9,10, hoewel andere vogelsoorten zijn ook gevoelig voor USUV infectie11. Onlangs werd uSUV ook geïdentificeerd in knaagdieren en spitsmuizen, hoewel hun potentiële rol in de overdracht van het virus onbekend blijft12. Bij de mens zijn asymptomatische infecties beschreven bij bloeddonoren13,14,15,16 terwijl uSUV-infecties ook zijn geassocieerd met encefalitis of meningo-encefalitis17,18. In Nederland werd uSUV voor het eerst aangetroffen bij wilde vogels in 201610 en bij asymptomatische bloeddonoren in 201814. Sinds de eerste detectie van usuv, uitbraken zijn gemeld tijdens de daaropvolgende jaren en toezicht, met inbegrip van hele genoom sequencing, is momenteel aan de gang om de ontstaan en verspreiding van een arbovirus in een voorheen naïeve bevolking te controleren.
Vergelijkbaar met wat is beschreven voor andere virussen, zoals ebolavirus, Zika virus en gele koorts virus3,19,20, hebben we een primer ingesteld op de volledige lengte USUV21sequentie . Deze polymerase kettingreactie (PCR)-gebaseerde aanpak maakt het mogelijk om full length USUV-genomen te herstellen van zeer host-contaminated sample types zoals hersenmonsters in monsters tot een Ct-waarde van ongeveer 32. Voordelen van een op amplicon gebaseerde sequencing-benadering zijn een hogere gevoeligheid in vergelijking met metagenomische sequencing en een hogere specificiteit. Beperkingen van het gebruik van een amplicon-gebaseerde aanpak zijn dat de sequenties moeten vergelijkbaar zijn om primers montage van alle stammen te ontwerpen en dat primers zijn ontworpen op onze huidige kennis over het virus diversiteit.
Gezien de constante ontwikkelingen en verbeteringen in de volgorde van de derde generatie, is het noodzakelijk om het foutenpercentage van de sequencer regelmatig te evalueren. Hier beschrijven we een methode om de prestaties van nanoporie direct te evalueren tegen Illumina sequencing met behulp van USUV als voorbeeld. Deze methode wordt toegepast op sequenties gegenereerd met de nieuwste R10 flow cel en basecalling wordt uitgevoerd met de nieuwste versie van de flip-flop basecaller.
Nanopore sequencing is voortdurend in ontwikkeling en daarom is er behoefte aan methoden om het foutenpercentage te controleren. Hier beschrijven we een workflow om het foutenpercentage van de nanoporiesequencer te controleren. Dit kan handig zijn na het vrijgeven van een nieuwe stroomcel, of als er nieuwe releases van de basecalling worden vrijgegeven. Dit kan echter ook handig zijn voor gebruikers die hun eigen sequencingprotocol willen instellen en valideren.
Verschillende software- en uitlijningstools kunnen verschillende resultaten opleveren33. In dit manuscript wilden we vrij beschikbare softwarepakketten gebruiken die veel worden gebruikt en die duidelijke documentatie hebben. In sommige gevallen kan de voorkeur worden gegeven aan commerciële instrumenten, die over het algemeen een gebruiksvriendelijkere interfaces hebben, maar moeten worden betaald. In de toekomst kan deze methode op hetzelfde monster worden toegepast in het geval grote wijzigingen in sequentietechnologie of basecallingsoftware worden geïntroduceerd Bij voorkeur moet dit gebeuren na elke update van de basecaller of flowcell, maar gezien de snelheid van de huidige ontwikkelingen kan dit ook pas na grote updates worden gedaan.
De vermindering van het foutenpercentage in sequencing zorgt voor een hoger aantal monsters te worden multiplexed. Daardoor komt nanoporiesequencing steeds dichter bij het vervangen van conventionele real-time PCRs voor diagnostische tests, wat al het geval is voor influenzavirusdiagnostiek. Bovendien verhoogt de vermindering van het foutenpercentage de bruikbaarheid van deze technieksequencing, bijvoorbeeld voor de bepaling van kleine varianten en voor onpartijdige metagenomische sequencing met hoge doorvoer.
Een kritieke stap in het protocol is dat er nauwe, betrouwbare referentiesequenties beschikbaar moeten zijn. De primers zijn gebaseerd op de huidige kennis over virusdiversiteit en moeten mogelijk af en toe worden bijgewerkt. Een ander kritiek punt bij het opzetten van een op amplicon gebaseerde sequencing-benadering is het balanceren van de primerconcentratie om een gelijkmatigevenwicht in amplicondiepte te krijgen. Dit maakt het mogelijk om meer monsters op een reeks te laten uitvoeren en resulteert in een aanzienlijke kostenbesparing.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk heeft financiering ontvangen van het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie in het kader van subsidieovereenkomst nr.
Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
dNTPs | Qiagen | 201900 | |
FLO-MIN106 R10 flowcell | Nanopore | R10 flowcell | |
KAPA Hyperplus libarary preparation kit | Roche | 7962436001 | |
Library Loading Bead Kit | Nanopore | EXP-LLB001 | |
Ligation Sequencing Kit 1D | Nanopore | SQK-LSK109 | |
Native Barcoding Kit 1D 1-12 | Nanopore | EXP-NBD103 | |
Native Barcoding Kit 1D 13-24 | Nanopore | EXP-NBD104 | |
NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | NEB | M0367S | |
NEB Next Quick Ligation Module | NEB | E6056 | |
NEB Next Ultra II End Repair / dA-Tailing Module | NEB | E7546S | |
Protoscript II Reverse Transcriptase | NEB | M0368X | |
Q5 High-Fidelity polymerase | NEB | M0491 | |
Qubit dsDNA HS Assay kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
Random Primers | Promega | C1181 | |
RNAsin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 |