אימות הגנום השלם רצף Nanopore, באמצעות וירוס אוסוטו כדוגמה
Summary
בעבר שאנו אימות פרוטוקול עבור amplicon מבוסס הגנום השלם וירוס אוסוטו (אוסווי) רצף על פלטפורמת רצף nanopore. כאן, אנו מתארים את השיטות המשמשות בפירוט רב יותר ולקבוע את קצב השגיאה של תא הזרימה nanopore R10.
Abstract
רצף הגנום כולו יכול לשמש לאפיון ולמעקב התפרצויות ויראליות. Nanopore מבוססי פרוטוקולים רצף שלמות הגנום תוארו עבור מספר וירוסים שונים. גישות אלה לנצל את הגישה המבוססת על המבוסס על-ידי התקרבות, אשר ניתן להשתמש בה כדי למקד וירוס ספציפי או קבוצה של וירוסים הקשורים גנטית. בנוסף אישור של נוכחות וירוס, רצף יכול לשמש למחקרים אפידמיולוגיה גנומית, כדי לעקוב אחר וירוסים ולפענח מקורות, מאגרים ומצבי שידור. עבור יישומים כאלה, חיוני להבין את ההשפעות האפשריות של שיעור השגיאה המשויך לפלטפורמה הנמצאת בשימוש. יישום שגרתי בתחום הבריאות הקליני והציבורי דורש כי הדבר מתועד בכל שינוי חשוב בפרוטוקול. בעבר, פרוטוקול עבור שלמות הגנום אוסוטו רצף וירוס על פלטפורמת nanopore רצף היה מאומת (R 9.4 flowcell) על ידי השוואה ישירה ברצף המאיר. כאן, נתאר את השיטה המשמשת לקביעת כיסוי הקריאה הנדרש, תוך שימוש בהשוואה בין תא הזרימה R10 לבין רצף המאיר כדוגמה.
Introduction
התפתחויות מהירות בטכנולוגיות הדור השלישי מאפשרת לנו לנוע קדימה לקראת קרוב לרצף בזמן אמת במהלך התפרצויות ויראליות. זה הזמינות בזמן של מידע גנטי יכול להיות שימושי כדי לקבוע את המקור ואת האבולוציה של פתוגנים ויראלי. סטנדרטים זהב בתחומים של רצף הדור הבא עם זאת, הם עדיין הדור השני של הרצף. טכניקות אלה מסתמכות על טכניקות ספציפיות וגוזלת זמן כמו הגברה של שבטים במהלך ה-PCR של אמולסיה או הגברה של גשר המשובטים. הסקואים הדור השלישי זולים יותר, מוחזקים ביד ומגיעים עם מתודולוגיות פשוטות להכנה בספרייה. במיוחד הגודל הקטן של התקן הרצף ומחיר הרכישה הנמוך הופך אותו למועמד מעניין לרצף שניתן לפריסה. זה יכול להיות מופע להיראות במהלך התפרצות הנגיף האבולה בסיירה לאונה במהלך מתמשך בחקירת התפרצות מועבר בברזיל1,2,3. עם זאת, שיעור השגיאה הגבוה המדווח4 עשוי להגביל את היישומים שעבורם ניתן להשתמש ברצפי הnanopore.
רצף הNanopore מתפתח במהירות. מוצרים חדשים זמינים בשוק על בסיס קבוע. דוגמאות לכך הן למשל 1D בריבוע ערכות אשר מאפשר רצף של שני קווצות של מולקולת ה-DNA, ובכך להגביר את הדיוק של בסיסים שנקראו5 ואת הפיתוח של תא זרימה R10 אשר מודד את השינוי הנוכחי בשני מופעים שונים בנקבובית6. בנוסף, שיפור בכלים ביו-מגמטיים כמו שיפורים בבאסינג ישפרו את דיוק החיים7. אחד מהאולמרים הנפוצים ביותר, (לדוגמה, Albacore), עודכן לפחות 12 פעמים בפרקזמן של 9 חודשים. לאחרונה, היצרן גם פרסמה basecaller רומן בשם flip-פלופ, אשר מיושם בתוכנת nanopore ברירת המחדל8. יחד, כל השיפורים האלה יוביל לרצפים מדויקים יותר ויקטין את שיעור השגיאה של ברצף nanopore.
וירוס אוסוטו (אוסווי) הוא וירוס שנישא נגד יתושים של המשפחה Flaויוויאן והוא בעל הגנום החיובי של RNA שנתקע סביב 11,000 נוקלאוטידים. אוסוב משפיע בעיקר על הינשופים האפורים והשחורים9,10, למרות מינים אחרים של ציפורים רגישים גם לזיהום של אוסווי11. לאחרונה, התגלתה גם מכרסמים ושתן למרות שתפקידם הפוטנציאלי בתמסורת של הנגיף נשאר לא ידוע12. בבני אדם, זיהומים אסימפטומטיים תוארו בתורמיםדם 13,14,15,16 בעוד זיהומים אוסווי גם דווחו להיות משויכים לדלקת קרום המוח או17דלקת קרוםהמוח 17,18. בהולנד, אוסווי התגלתה לראשונה בציפורי בר ב-201610 ובתורמים דם ללא תסמינים ב-201814. מאז הגילוי הראשוני של אוסווי, התפרצויות דווחו במהלך השנים הבאות ומעקב, כולל רצף הגנום השלם, מתמשך כיום לפקח על להגיח והתפשטות של מועבר באוכלוסיה נאיבית בעבר.
בדומה למה שתואר עבור וירוסים אחרים, כגון נגיף האבולה, וירוס zika וירוס קדחת צהובה3,19,20, פיתחנו תחל להגדיר רצף מלא באורך אוסווי21. זו תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מבוסס גישה מאפשר התאוששות באורך מלא של הגנום ה-ea v מסוג מארח מאוד מזוהם סוגים כמו דגימות המוח בדגימות עד ערך Ct של סביב 32. היתרונות של הגישה ברצף מבוססי amplicon הם רגישות גבוהה יותר לעומת רצף מטאגנאומית וספציפיות יותר. מגבלות של שימוש amplicon מבוססי גישה הם כי רצפי צריך להיות דומה כדי לעצב התאמה התחל כל הזנים, כי התחל מתוכננים על הידע הנוכחי שלנו על גיוון וירוס.
בהינתן ההתפתחויות והשיפורים הקבועים ברצף הדור השלישי, יש צורך להעריך את שיעור השגיאה של הרצף על בסיס קבוע. כאן, אנו מתארים שיטה להעריך את הביצועים של nanopore ישירות נגד רצף המאיר באמצעות ה-אוסווי כדוגמה. שיטה זו מוחלת על רצפים שנוצרו עם התא העדכני ביותר R10 flow ו-basecalling מבוצעת עם הגירסה העדכנית ביותר של basecaller flip-פלופ.
Protocol
Representative Results
Discussion
רצף Nanopore מתפתחת כל הזמן ולכן יש צורך בשיטות כדי לפקח על שיעור השגיאה. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה כדי לפקח על שיעור השגיאה של nanopore רצף. הדבר יכול להיות שימושי לאחר שחרורו של תא זרימה חדש, או אם מהדורות חדשות של הביתא משוחררות. עם זאת, פעולה זו עשויה להיות שימושית גם עבור משתמשים המעוניינים להגדיר ולאמת את פרוטוקול הרצף שלהם.
כלי תוכנה ויישור שונים יכולים להניב תוצאות שונות33. בכתב יד זה, כיוונו להשתמש בחבילות תוכנה זמינות באופן חופשי, המשמשות בדרך כלל, ובהן תיעוד ברור. במקרים מסוימים, ניתן להעניק העדפה לכלים מסחריים, שבדרך כלל יש ממשקים ידידותיים יותר למשתמש, אך יש לשלם עבורם. בעתיד, שיטה זו יכולה להיות מוחלת על אותו מדגם במקרה של שינויים גדולים בטכנולוגיית רצף או התוכנה basecalling נג מוצגים המועדפת באופן זה צריך להיעשות לאחר כל עדכון של basecaller או הזרימה, עם זאת בהתחשב במהירות של ההתפתחויות הנוכחיות זה יכול להיעשות גם לאחר עדכונים גדולים.
הפחתת שיעור השגיאה ברצף מאפשרת מספר גבוה יותר של דגימות להיות מרובב. ובכך, רצף nanopore מתקרב להחלפת בדיקות קונבנציונאלי בזמן אמת האבחון האבחוני, אשר כבר במקרה של אבחון וירוס שפעת. בנוסף, הפחתת שיעור השגיאה מגבירה את השימושיות של רצף הטכניקה הזה, למשל לקביעת גרסאות משניות ולקביעת רצף מטגנאומית בתפוקה גבוהה.
שלב קריטי בפרוטוקול הוא שניתן להשיג רצפי הפניות אמינים ומהימנים. התחל מבוסס על הידע העדכני על גיוון וירוס וייתכן שיהיה צורך לעדכן מדי פעם. נקודה קריטית נוספת בעת הגדרת הגישה המבוססת על הרצף של אמפליקון היא האיזון של הריכוז הפריימר כדי לקבל איזון זוגי באמפליפי עומק. פעולה זו מאפשרת ריבוב של דגימות נוספות ברצף ומעלה הפחתת עלות משמעותית.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו קיבלה מימון של אופק 2020 האיחוד האירופי תוכנית מחקר וחדשנות תחת הסכם מענק מס ‘ 643476 (השווה).
Materials
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| dNTPs | Qiagen | 201900 | |
| FLO-MIN106 R10 flowcell | Nanopore | R10 flowcell | |
| KAPA Hyperplus libarary preparation kit | Roche | 7962436001 | |
| Library Loading Bead Kit | Nanopore | EXP-LLB001 | |
| Ligation Sequencing Kit 1D | Nanopore | SQK-LSK109 | |
| Native Barcoding Kit 1D 1-12 | Nanopore | EXP-NBD103 | |
| Native Barcoding Kit 1D 13-24 | Nanopore | EXP-NBD104 | |
| NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | NEB | M0367S | |
| NEB Next Quick Ligation Module | NEB | E6056 | |
| NEB Next Ultra II End Repair / dA-Tailing Module | NEB | E7546S | |
| Protoscript II Reverse Transcriptase | NEB | M0368X | |
| Q5 High-Fidelity polymerase | NEB | M0491 | |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | |
| RNAsin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 |
References
- Faria, N. R., et al. Establishment and cryptic transmission of Zika virus in Brazil and the Americas. Nature. 546 (7658), 406-410 (2017).
- Bonaldo, M. C., et al. Genome analysis of yellow fever virus of the ongoing outbreak in Brazil reveals polymorphisms. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (6), 447-451 (2017).
- Faria, N. R., et al. Genomic and epidemiological monitoring of yellow fever virus transmission potential. bioRxiv. , 299842 (2018).
- Magi, A., Giusti, B., Tattini, L. Characterization of MinION nanopore data for resequencing analyses. Briefings in Bioinformatics. 18 (6), bbw077 (2016).
- Rang, F. J., Kloosterman, W. P., de Ridder, J. From squiggle to basepair: computational approaches for improving nanopore sequencing read accuracy. Genome Biology. 19 (1), 90 (2018).
- . Nanopore Store, R10 flow cells Available from: https://store.nanoporetech.com/flowcells/spoton-flow-cell-mk-i-r10.html (2019)
- Wick, R. R., Judd, L. M., Holt, K. E. Performance of neural network basecalling tools for Oxford Nanopore sequencing. Genome Biology. 20 (1), 129 (2019).
- . GitHub – nanoporetech/flappie: Flip-flop basecaller for Oxford Nanopore reads Available from: https://github.com/nanoporetech/flappie (2019)
- Lühken, R., et al. Distribution of Usutu Virus in Germany and Its Effect on Breeding Bird Populations. Emerging Infectious Diseases. 23 (12), 1994-2001 (2017).
- Cadar, D., et al. Widespread activity of multiple lineages of Usutu virus, Western Europe, 2016. Eurosurveillance. 22 (4), (2017).
- Becker, N., et al. Epizootic emergence of Usutu virus in wild and captive birds in Germany. PLoS ONE. 7 (2), (2012).
- Diagne, M., et al. Usutu Virus Isolated from Rodents in Senegal. Viruses. 11 (2), 181 (2019).
- Bakonyi, T., et al. Usutu virus infections among blood donors, Austria, July and August 2017 – Raising awareness for diagnostic challenges. Eurosurveillance. 22 (41), (2017).
- Zaaijer, H. L., Slot, E., Molier, M., Reusken, C. B. E. M., Koppelman, M. H. G. M. Usutu virus infection in Dutch blood donors. Transfusion. , trf.15444 (2019).
- Cadar, D., et al. Blood donor screening for West Nile virus (WNV) revealed acute Usutu virus (USUV) infection, Germany, September 2016. Eurosurveillance. 22 (14), 30501 (2017).
- Pierro, A., et al. Detection of specific antibodies against West Nile and Usutu viruses in healthy blood donors in northern Italy, 2010–2011. Clinical Microbiology and Infection. 19 (10), E451-E453 (2013).
- Pecorari, M., et al. First human case of Usutu virus neuroinvasive infection, Italy, August-September 2009. Euro surveillance: bulletin européen sur les maladies transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 14 (50), (2009).
- Simonin, Y., et al. Human Usutu Virus Infection with Atypical Neurologic Presentation, Montpellier, France, 2016. Emerging Infectious Diseases. 24 (5), 875-878 (2018).
- Quick, J., et al. Multiplex PCR method for MinION and Illumina sequencing of Zika and other virus genomes directly from clinical samples. Nature Protocols. 12 (6), 1261-1276 (2017).
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).
- Oude Munnink, B. B., et al. Towards high quality real-time whole genome sequencing during outbreaks using Usutu virus as example. Infection, Genetics and Evolution. 73, 49-54 (2019).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W. GenBank. Nucleic Acids Research. 38 (Database issue), D46-D51 (2010).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research. 32 (5), 1792-1797 (2004).
- . GitHub – rrwick/Porechop: adapter trimmer for Oxford Nanopore reads Available from: https://github.com/rrwick/porechop (2018)
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
- Li, H. Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics. 34 (18), 3094-3100 (2018).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics (Oxford, England). 30 (15), 2114-2120 (2014).
- . BBMap download | SourceForge.net Available from: https://sourceforge.net/projects/bbmap/ (2019)
- Bankevich, A., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).
- Clausen, P. T. L. C., Aarestrup, F. M., Lund, O. Rapid and precise alignment of raw reads against redundant databases with KMA. BMC Bioinformatics. 19 (1), 307 (2018).
- Brinkmann, A., et al. Proficiency Testing of Virus Diagnostics Based on Bioinformatics Analysis of Simulated In Silico High-Throughput Sequencing Data Sets. Journal of Clinical Microbiology. 57 (8), (2019).
