Tüm Genom Nanopore Sıralama doğrulama, Örnek olarak Usutu Virüs kullanarak
Summary
Daha önce bir nanopore sıralama platformu üzerinde amplicon tabanlı tüm genom Usutu virüsü (USUV) sıralama için bir protokol doğruladı. Burada, daha ayrıntılı olarak kullanılan yöntemleri açıklar ve nanopore R10 akış hücresinin hata oranını belirleriz.
Abstract
Tüm genom dizilimi viral salgınları karakterize etmek ve izlemek için kullanılabilir. Nanopore tabanlı tüm genom dizileme protokolleri birkaç farklı virüs için tanımlanmıştır. Bu yaklaşımlar, belirli bir virüsü veya genetik olarak ilişkili virüs grubunu hedeflemek için kullanılabilecek örtüşen amplikon temelli bir yaklaşım kullanır. Virüs varlığının teyidine ek olarak, dizileme genomik epidemiyoloji çalışmaları için, virüsleri izlemek ve kökeni, rezervuarları ve bulaşma modlarını çözmek için kullanılabilir. Bu tür uygulamalar için, kullanılan platformile ilişkili hata oranının olası etkilerini anlamak çok önemlidir. Klinik ve genel sağlık ortamlarında rutin uygulama, protokoldeki her önemli değişiklikle belgelenmeyi gerektirir. Daha önce, nanopore sıralama platformunda tüm genom Usutu virüs dizilimi için bir protokol (R9.4 flowcell) Illumina sıralama doğrudan karşılaştırıldığında doğrulandı. Burada, R10 akış hücresi ile Illumina dizilimi arasındaki karşılaştırmayı örnek olarak kullanarak gerekli okuma kapsamını belirlemek için kullanılan yöntemi açıklıyoruz.
Introduction
Üçüncü nesil dizi teknolojilerinde hızlı gelişmeler, viral salgınlar sırasında gerçek zamanlı sıralamaya yakın bir şekilde ilerlememizi sağlar. Genetik bilginin bu zamanında kullanılabilirliği viral patojenlerin kökeni ve evrimini belirlemek için yararlı olabilir. Ancak yeni nesil sıralama alanlarında altın standartlar, hala ikinci nesil sequencers vardır. Bu teknikler, emülsiyon PCR veya klonal köprü amplifikasyonu sırasında klonal amplifikasyon gibi belirli ve zaman alıcı teknikler kullanır. Üçüncü nesil sequencers ucuz, el ve basitleştirilmiş kütüphane hazırlama metodolojileri ile birlikte gelir. Özellikle sıralı cihazın küçük boyutu ve düşük satın alma fiyatı onu konuşlandırılabilir, alana uygun sıralama için ilginç bir aday yapar. Bu örneğin Sierra Leone Ebola virüs salgını sırasında veBrezilya’dadevam eden arbovirüs salgını soruşturmaları sırasında görülebilir 1,2,3. Ancak, bildirilen yüksek hata oranı4 nanopore sıralama kullanılabilir uygulamaları sınırlayabilir.
Nanopore sıralama hızla gelişmektedir. Yeni ürünler piyasada düzenli olarak mevcuttur. Buna örnek olarak, DNA molekülünün her iki iplikçiğinin dizilemesini sağlayan 1D kare kitleri, böylece adlandırılan bazlar5’in doğruluğunu artırma ve gözenek6’dakiiki farklı durumda akımdaki değişimi ölçen R10 akış hücresinin geliştirilmesi verilebilir. Buna ek olarak, basecalling iyileştirmeler gibi geliştirilmiş biyo-informatik araçlar basecallingdoğruluğunu artıracaktır 7. En sık kullanılan basecallers biri, (örneğin, Albacore), 9 aylık bir süre içinde en az 12 kez güncellendi5. Son zamanlarda, üretici de varsayılan nanopore yazılım8uygulanan flip-flop denilen yeni bir basecaller yayımladı. Birlikte, tüm bu geliştirmeler daha doğru dizileri yol açacakve nanopore sequencer hata oranını azaltacaktır.
Usutu virüsü (USUV) Flaviviridae familyasından sivrisinek kaynaklı bir arbovirüstür ve yaklaşık 11.000 nükleotitlik pozitif iplikli RNA genomuna sahiptir. USUV esas olarak büyük gri baykuşlar ve karakuşlar etkiler9,10, diğer kuş türleri de USUV enfeksiyonu duyarlı olmasına rağmen11. Son zamanlarda, USUV da kemirgenler ve sivri fareler de tespit edildi virüs iletimi potansiyel rolü bilinmeyen kalır rağmen12. İnsanlarda, asemptomatik enfeksiyonlar kan bağışçılarında tarif edilmiştir13,14,15,16 USUV enfeksiyonları da ensefalit veya meningo-ensefalit ile ilişkili olduğu bildirilmiştir17,18. Hollanda’da USUV ilk olarak 2016 yılında yabanikuşlarda, 2018 yılında ise asemptomatik kan bağışçılarında tespit edilmiştir.14 USUV’nin ilk tespitinden bu yana, sonraki yıllarda salgınlar rapor edilmiştir ve tüm genom dizilemesi de dahil olmak üzere gözetim, şu anda daha önce naif bir popülasyonda bir arbovirüsün ortaya çıkmasını ve yayılmasını izlemek için devam etmektedir.
Ebola virüsü, Zika virüsü ve sarı hummavirüsü3,19,,20gibi diğer virüsler için açıklanan benzer, biz tam uzunlukta USUV21diziiçin bir astar seti geliştirdik. Bu polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı yaklaşım, numunelerde beyin örnekleri gibi yüksek oranda kontamine olmuş numune tiplerinden tam uzunlukta USUV genomlarının 32 civarında ct değerine kadar geri kazanılmasına olanak sağlar. Amplicon tabanlı sıralama yaklaşımının yararları metagenomik sıralamaya göre daha yüksek duyarlılık ve daha yüksek özgüllüktür. Amplicon tabanlı bir yaklaşım kullanmanın sınırlamaları, dizilerin tüm suşlara uyan astarlar tasarlamak için benzer olması ve astarların virüs çeşitliliği hakkındaki mevcut bilgimiz üzerine tasarlanmasıdır.
Üçüncü nesil sıralamadaki sürekli gelişmeler ve gelişmeler göz önüne alındığında, sıralayıcının hata oranını düzenli olarak değerlendirmek gerekir. Burada, nanopore performansını doğrudan Illumina sıralamasına karşı değerlendirmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem en son R10 akış hücresi ile oluşturulan dizilere uygulanır ve flip-flop basecaller’ın en son sürümü ile basecalling gerçekleştirilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nanopore sıralama sürekli gelişmektedir ve bu nedenle hata oranını izlemek için yöntemler için bir ihtiyaç vardır. Burada, nanopore sequencer hata oranını izlemek için bir iş akışı açıklar. Bu, yeni bir akış hücresi yayımlandıktan sonra veya basecalling’in yeni sürümleri serbest bırakılırsa yararlı olabilir. Ancak, bu, kendi sıralama protokollerini ayarlamak ve doğrulamak isteyen kullanıcılar için de yararlı olabilir.
Farklı yazılım ve hizalama araçları farklı sonuçlar verebilir33. Bu yazıda, yaygın olarak kullanılan ve açık belgelere sahip serbestçe kullanılabilen yazılım paketlerini kullanmayı amaçladık. Bazı durumlarda, tercih genellikle daha kullanıcı dostu arabirimleri var ama için ödenmesi gereken ticari araçlar, verilebilir. Gelecekte, bu yöntem sıralı teknoloji veya basecalling yazılım büyük değişiklikler tercihen bu basecaller veya flowcell her güncellemeden sonra yapılmalıdır tanıtılır durumunda aynı örnek uygulanabilir, ancak mevcut gelişmelerin hızı göz önüne alındığında bu da sadece büyük güncellemeler sonra yapılabilir.
Sıralamadaki hata oranındaki azalma, daha fazla sayıda örneğin çokkatlı olmasını sağlar. Bu nedenle, nanopore sıralama zaten grip virüsü tanı için durumdur tanı tahliller için geleneksel gerçek zamanlı PCRs yerine daha yakın oluyor. Buna ek olarak, hata oranının azaltılması, örneğin küçük varyantların belirlenmesi ve yüksek iş sahibi tarafsız metagenomik sıralama için bu tekniğin kullanılabilirliğini artırır.
Protokoldeki kritik bir adım, yakın ve güvenilir başvuru dizilerinin kullanılabilir olması gerektiğidir. Astarlar virüs çeşitliliği hakkında güncel bilgilere dayanmaktadır ve arada bir güncellenmesi gerekebilir. Amplicon tabanlı sıralama yaklaşımı kurarken bir diğer kritik nokta, amplicon derinliğinde eşit bir denge elde etmek için astar konsantrasyonunun dengelenmesidir. Bu, bir dizi çalışmasında daha fazla örneğin çoklaşmasını sağlar ve önemli bir maliyet azaltmayla sonuçlanır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, 643476 sayılı hibe anlaşması (COMPARE) kapsamında Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programından fon almıştır.
Materials
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| dNTPs | Qiagen | 201900 | |
| FLO-MIN106 R10 flowcell | Nanopore | R10 flowcell | |
| KAPA Hyperplus libarary preparation kit | Roche | 7962436001 | |
| Library Loading Bead Kit | Nanopore | EXP-LLB001 | |
| Ligation Sequencing Kit 1D | Nanopore | SQK-LSK109 | |
| Native Barcoding Kit 1D 1-12 | Nanopore | EXP-NBD103 | |
| Native Barcoding Kit 1D 13-24 | Nanopore | EXP-NBD104 | |
| NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | NEB | M0367S | |
| NEB Next Quick Ligation Module | NEB | E6056 | |
| NEB Next Ultra II End Repair / dA-Tailing Module | NEB | E7546S | |
| Protoscript II Reverse Transcriptase | NEB | M0368X | |
| Q5 High-Fidelity polymerase | NEB | M0491 | |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | |
| RNAsin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 |
References
- Faria, N. R., et al. Establishment and cryptic transmission of Zika virus in Brazil and the Americas. Nature. 546 (7658), 406-410 (2017).
- Bonaldo, M. C., et al. Genome analysis of yellow fever virus of the ongoing outbreak in Brazil reveals polymorphisms. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (6), 447-451 (2017).
- Faria, N. R., et al. Genomic and epidemiological monitoring of yellow fever virus transmission potential. bioRxiv. , 299842 (2018).
- Magi, A., Giusti, B., Tattini, L. Characterization of MinION nanopore data for resequencing analyses. Briefings in Bioinformatics. 18 (6), bbw077 (2016).
- Rang, F. J., Kloosterman, W. P., de Ridder, J. From squiggle to basepair: computational approaches for improving nanopore sequencing read accuracy. Genome Biology. 19 (1), 90 (2018).
- . Nanopore Store, R10 flow cells Available from: https://store.nanoporetech.com/flowcells/spoton-flow-cell-mk-i-r10.html (2019)
- Wick, R. R., Judd, L. M., Holt, K. E. Performance of neural network basecalling tools for Oxford Nanopore sequencing. Genome Biology. 20 (1), 129 (2019).
- . GitHub – nanoporetech/flappie: Flip-flop basecaller for Oxford Nanopore reads Available from: https://github.com/nanoporetech/flappie (2019)
- Lühken, R., et al. Distribution of Usutu Virus in Germany and Its Effect on Breeding Bird Populations. Emerging Infectious Diseases. 23 (12), 1994-2001 (2017).
- Cadar, D., et al. Widespread activity of multiple lineages of Usutu virus, Western Europe, 2016. Eurosurveillance. 22 (4), (2017).
- Becker, N., et al. Epizootic emergence of Usutu virus in wild and captive birds in Germany. PLoS ONE. 7 (2), (2012).
- Diagne, M., et al. Usutu Virus Isolated from Rodents in Senegal. Viruses. 11 (2), 181 (2019).
- Bakonyi, T., et al. Usutu virus infections among blood donors, Austria, July and August 2017 – Raising awareness for diagnostic challenges. Eurosurveillance. 22 (41), (2017).
- Zaaijer, H. L., Slot, E., Molier, M., Reusken, C. B. E. M., Koppelman, M. H. G. M. Usutu virus infection in Dutch blood donors. Transfusion. , trf.15444 (2019).
- Cadar, D., et al. Blood donor screening for West Nile virus (WNV) revealed acute Usutu virus (USUV) infection, Germany, September 2016. Eurosurveillance. 22 (14), 30501 (2017).
- Pierro, A., et al. Detection of specific antibodies against West Nile and Usutu viruses in healthy blood donors in northern Italy, 2010–2011. Clinical Microbiology and Infection. 19 (10), E451-E453 (2013).
- Pecorari, M., et al. First human case of Usutu virus neuroinvasive infection, Italy, August-September 2009. Euro surveillance: bulletin européen sur les maladies transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 14 (50), (2009).
- Simonin, Y., et al. Human Usutu Virus Infection with Atypical Neurologic Presentation, Montpellier, France, 2016. Emerging Infectious Diseases. 24 (5), 875-878 (2018).
- Quick, J., et al. Multiplex PCR method for MinION and Illumina sequencing of Zika and other virus genomes directly from clinical samples. Nature Protocols. 12 (6), 1261-1276 (2017).
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).
- Oude Munnink, B. B., et al. Towards high quality real-time whole genome sequencing during outbreaks using Usutu virus as example. Infection, Genetics and Evolution. 73, 49-54 (2019).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W. GenBank. Nucleic Acids Research. 38 (Database issue), D46-D51 (2010).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research. 32 (5), 1792-1797 (2004).
- . GitHub – rrwick/Porechop: adapter trimmer for Oxford Nanopore reads Available from: https://github.com/rrwick/porechop (2018)
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
- Li, H. Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics. 34 (18), 3094-3100 (2018).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics (Oxford, England). 30 (15), 2114-2120 (2014).
- . BBMap download | SourceForge.net Available from: https://sourceforge.net/projects/bbmap/ (2019)
- Bankevich, A., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).
- Clausen, P. T. L. C., Aarestrup, F. M., Lund, O. Rapid and precise alignment of raw reads against redundant databases with KMA. BMC Bioinformatics. 19 (1), 307 (2018).
- Brinkmann, A., et al. Proficiency Testing of Virus Diagnostics Based on Bioinformatics Analysis of Simulated In Silico High-Throughput Sequencing Data Sets. Journal of Clinical Microbiology. 57 (8), (2019).
