Validación de la secuenciación de nanoporos del genoma completo, utilizando el virus Usutu como ejemplo

NOTA: Lista de herramientas de software que se utilizarán: usearch v11.0.667; músculo v3.8.1551; porechop 0.2.4; cutadapt 2.5; minimapa2 2.16-r922; samtools 1.9; trimmomatic 0,39; bbmap 38.33; picas v3.13.1; kma-1.2.8 1. Diseño de imprimación 2. Multiplex PCR Realice el PCR multiplex utilizando las imprimaciones y nanoporas diseñadas y la secuenciación de Illumina. El PCR multiplex para USUV se realizó como se describió anteriormente19,21. Realice la llamada base con la versión 3.0.6.6+9999d81. 3. Análisis de datos para generar secuencias de consenso a partir de datos de nanoporos Se pueden multiplexar varias muestras en una sola ejecución de secuenciación de nanoporos. Después de realizar la ejecución de la secuencia, demultiplexe los datos de nanoporos. Usa Porechop25 para esto. Para evitar la contaminación y mejorar la precisión, utilice el require_two_barcodes bandera. En la línea de comando, escriba:- porechop -i Run_USUV.fastq -o Run_USUV_demultiplex -require_two_barcodes Después de la desmultiplexación, elimine las secuencias de imprimación (indicadas en el archivo Primers_Usutu.fasta en ambas orientaciones) utilizando cutadapt26. Además, elimine secuencias con una longitud inferior a 75 nucleótidos. Los imprimadores tienen que ser eliminados ya que pueden introducir sesgos artificiales en la secuencia de consenso. En la línea de comando, escriba:- cutadapt -b archivo:Primers_USUV.fasta -o BC01_trimmed.fastq BC01.fastq -m 75 Las lecturas de secuencia desmultiplexadas se pueden asignar a un panel de deformaciones unitarias distintas mediante minimap227 y se puede generar una secuencia de consenso utilizando samtools28. Siga el ejemplo siguiente que muestra el procedimiento de una alineación basada en referencias y la generación de secuencias de consenso de una muestra: BC01. En la línea de comando, escriba:- minimap2 -ax map-ont Random_Refs_USUV.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01.bam- samtools ordenar BC01.bam > BC01_sorted.bam- bcftools mpileup -Ou -f Random_Refs_USUV.fasta BC01_sorted.bam – bcftools call -mv -Oz -o BC01.vcf.gz- bcftools índice BC01.vcf.gz- gato Random_Refs_USUV.fasta – consenso bcftools BC01.vcf.gz > BC01_consensus.fasta Para las alineaciones basadas en referencias es esencial que se utilice una secuencia de referencia estrechamente relacionada. Por lo tanto, realice una búsqueda BlastN con la secuencia de consenso generada para identificar la cepa de referencia más cercana. Después de eso, repita la alineación basada en referencias con la deformación unitaria de referencia más cercana como referencia (paso3.3 y 3.4). En la línea de comando, escriba:- minimap2 -ax map-ont Ref_USUV_BC01.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01_ref.bam- samtools sort BC01_ref.bam > BC01_sorted_ref.bam- bcftools mpileup -Ou -f Ref_USUV_BC01.fasta BC01_sorted_ref.bam á bcftools call -mv -Oz -o BC01_ref.vcf.gz- índice bcftools BC01_ref.vcf.gz- Ref_USUV_BC01 de gatos: el consenso bcftools BC01_ref.vcf.gz > BC01_ref_consensus.fasta 4. Análisis de los datos de Illumina Estas secuencias se demultiplexan automáticamente después de la secuenciación. Las lecturas se pueden controlar con la calidad mediante trimmomatic29. Para secuencias de Illumina de extremo emparejado, utilice la puntuación PHRED mediana de corte comúnmente utilizada de 33 y una longitud de lectura mínima de 75 para obtener lecturas precisas y de alta calidad. En la línea de comando, escriba:- TRIMmomatic PE -phred33 9_S9_L001_R1_001.fastq.gz 9_S9_L001_R2_001.fastq.gz 9_1P.fastq 9_1U.fastq 9_2P.fastq 9_2U.fastq LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:3:15 MINLEN:75 Eliminar imprimaciones (indicadas en el archivo Primers_Usutu.fasta en ambas orientaciones), ya que pueden introducir sesgos artificiales, utilizando cutadapt26. Además, elimine secuencias con una longitud inferior a 75 nucleótidos utilizando los comandos siguientes. En la línea de comando, escriba:- cutadapt -b o 9_1P_trimmed.fastq -p 9_2P_trimmed.fastq 9_1P.fastq 9_2P.fastq -m 75 Antes del montaje de novo, las lecturas de la secuencia se pueden normalizar para una cobertura uniforme a través del genoma. Esto es esencial ya que los ensambladores de novo como SPAdes tienen en cuenta la cobertura de lectura al ensamblar lecturas de secuencia. Normalizar las lecturas a una cobertura de lectura de 50 utilizando BBNorm desde el paquete BBMap30. En la línea de comando, escriba:- bbmap/bbnorm.sh target-50 in-9_1P_trimmed.fastq in2-9_2P_trimmed.fastq out-Sample9_FW_norm.fastq out2-Sample9_RE_norm.fastq Las lecturas normalizadas se ensamblan de novo utilizando SPAdes31. La configuración predeterminada se utiliza para el ensamblaje utilizando todos los kilómetros diferentes (21, 33, 55, 77, 99 y 127). En la línea de comando, escriba:- spades.py -k 21,33,55,77,99,127 -o Sample9 -1 Sample9.qc.f.fq -2 Sample9.qc.r.fq Mapear el QC lee en contra de la secuencia de consenso obtenida usando minimap2 y programas como Geneious, Bioedit o Ugene para curar la alineación. Es importante comprobar el principio y el final de la contig. Alinee las lecturas de control de calidad con la secuencia de consenso obtenida mediante minimap2. Importe la alineación en Geneious/Bioedit/UGene. Inspeccione, corrija y comisaria manualmente el principio y el final del genoma. 5. Determinar la cobertura de lectura requerida para compensar el perfil de error en la secuenciación de nanoporos utilizando datos de Illumina como estándar de oro Seleccionar secuencia lee la asignación a un amplicon, en este caso amplicon 26. Posteriormente, mapear las lecturas de nanoporos contra este amplicon usando minimap2. Utilice Samtools para seleccionar solo la asignación de lecturas para amplificar 26 y convertir el archivo bam en fastq. En la línea de comando, escriba:- minimap2 -ax map-ont -m 150 Amplicon26.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01.bam- vista samtools -b -F 4 BC01.bam > BC01_mapped.bam- samtools bam2fq BC01_mapped.bam á seqtk seq – -> BC01_mapped.fastq Seleccione aleatoriamente subconjuntos de, por ejemplo, 200 secuencias, lecturas mil veces. Por ejemplo, cambiarlo a 10 dará como resultado la selección aleatoria de mil veces un subconjunto de 10 lecturas de secuencia. El script se proporciona como archivo complementario 1. En la línea de comando, escriba:- pitón Random_selection.py Todas las lecturas de secuencia seleccionadas aleatoriamente se alinean para amplificar 26. Utilice KMA32 para asignar las lecturas de secuencia y generar inmediatamente una secuencia de consenso. Utilice ajustes optimizados para la secuenciación de nanoporos, indicados por el indicador -bcNano. En la línea de comando, escriba:- kma index -i Amplicon26.fasta- para el archivo en random_sample*;- sampleID-$-file%.fastq– kma -i $-sampleID-.fastq -o $-sampleID- -t_db Amplicon26.fasta -mem_mode -mp 5 -mrs 0.0 -bcNano- hecho Inspeccione las secuencias de consenso generadas en la línea de comandos utilizando:- gato *.fsa > All_genomes.fsa- minimap2 -ax map-ont Amplicon26.fasta All_genomes.fsa > All_genomes.bam- samtools sort All_genomes.bam > All_genomes_sorted.bam- estadísticas de samtools All_genomes_sorted.bam > stats.txt La tasa de error se muestra en stats.txt en la tasa de error de encabezado #mismatches / bases asignadas. Visualízquelo en la pantalla con el siguiente comando:- grep -SN stats.txt – corte -f 2- La cantidad de indels se muestra bajo la partida #Indels por ciclo. Visualízquelo en la pantalla con el siguiente comando:- grep -IC stats.txt – corte -f 2-