Caratterizzazione della differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani mediante analisi RNA-Seq

I cheratinociti primari umani derivati dalla pelle umana sono spesso usati come modello cellulare per studiare la biologia dell’epidermide^1,2,3,4. La stratificazione dell’epidermide può essere modellata dalla differenziazione dei cheratinociti, sia in modo monostrato sommerso 2D che nel modello organotipico di sollevamento dell’aria 3D^2,3,5,6,7. Sebbene i modelli 3D siano diventati sempre più importanti per valutare la struttura e la funzione epidermica, i modelli di differenziazione 2D sono ancora ampiamente utilizzati, a causa della loro convenienza e della possibilità di generare un gran numero di cellule per le analisi.

Varie condizioni sono state applicate per indurre la differenziazione dei cheratinociti in 2D, tra cui l’aggiunta di siero, alta concentrazione di calcio, temperatura più bassa e inibizione dei recettori del fattore di crescita epidermico^2,3. Ognuno di questi metodi è stato convalidato da una serie di geni marcatori di differenziazione dei cheratinociti e si è dimostrato efficace nel valutare la differenziazione dei cheratinociti, anche in condizioni patologiche. Tuttavia, queste condizioni di induzione mostrano anche differenze nella loro efficienza di differenziazione e cinetica quando vengono esaminati pannelli specifici^{di geni marcatori 2,3}.

Uno di questi metodi prevede l’inibizione del contatto dei cheratinociti e l’esaurimento dei fattori di crescita nel mezzo^{di coltura 8}. È stato dimostrato che i cheratinociti possono differenziarsi spontaneamente quando le cellule raggiungono la piena densità.  Escludere i fattori di crescita nel mezzo di coltura può migliorare ulteriormente la differenziazione. Il metodo che combina l’inibizione del contatto e l’esaurimento dei fattori di crescita ha dimostrato di generare cheratinociti differenziati con modelli di espressione genica simili alla normale epidermide stratificata quando si utilizzano diversi marcatori epidermici³, suggerendo che questo modello è adatto per studiare la normale differenziazione dei cheratinociti. Recentemente, sono state riportate due analisi complete dell’espressione genica della differenziazione dei cheratinociti^{utilizzando questo modello 9,10}. I ricercatori hanno convalidato questo modello a livello molecolare e hanno dimostrato che può essere utilizzato per studiare la differenziazione dei cheratinociti normale e masabile.

Questo protocollo descrive la procedura per il metodo di differenziazione in vitro e l’analisi molecolare di cellule differenziate utilizzando RNA-seq. Illustra anche la caratterizzazione del trascritoma delle cellule nel giorno di differenziazione 0 (fase di proliferazione), giorno 2, giorno 4 e giorno 7 (differenziazione precoce, media e tardiva, rispettivamente). È dimostrato che i cheratinociti differenziati mostrano schemi di espressione genica che assomigliano in gran parte alle cellule durante la stratificazione epidermica. Per esaminare se questo metodo può essere utilizzato per lo studio della patologia cutanea, abbiamo applicato la stessa pipeline sperimentale e di analisi per indagare i cheratinociti che portano mutazioni del fattore di trascrizione p63 che derivano da pazienti con ectrodattilia, displasia ectodermica e sindrome labbro/palatoschisi (CEE)^11,12. Questo protocollo si concentra sulla differenziazione in vitro dei cheratinociti e sulla successiva analisi bioinformatica dell’RNA-seq. Altri passaggi della procedura completa come l’estrazione dell’RNA, la preparazione del campione RNA-seq e la costruzione della biblioteca, sono ben documentati e possono essere facilmente seguiti, specialmente quando si utilizzano molti kit commerciali comunemente usati. Pertanto, questi passaggi sono descritti solo brevemente nel protocollo. I dati mostrano che questa pipeline è adatta per studiare eventi molecolari durante la differenziazione epidermica in cheratinociti sani e materici.