Характеристика в пробирке Дифференциация первичных кератиноцитов человека с помощью анализа РНК-Сек

Первичные кератиноциты человека, полученные из кожи человека, часто используются в качестве клеточной модели для изучения^{биологии эпидермиса 1,2,3,4.} Стратификация эпидермиса может быть смоделирована с помощью дифференциации кератиноцитов, либо в 2D погруженном монослойном моде, либо в 3D органотипической^{модели 2,3,5,6,7.} Хотя 3D-модели становятся все более важными для оценки эпидермальной структуры и функции, 2D модели дифференциации по-прежнему широко используются, в связи с их удобством и возможностью генерировать большое количество клеток для анализа.

Различные условия были применены для индуцирования дифференциации кератиноцитов в 2D, в том числе добавление сыворотки, высокая концентрация кальция, более низкая температура и ингибирование рецепторов^{эпидермального фактора роста 2,3}. Каждый из этих методов был проверен рядом генов маркера дифференциации кератиноцитов и показал свою эффективность в оценке дифференциации кератиноцитов, в том числе в патологических условиях. Тем не менее, эти условия индукции также показывают различия в эффективности их дифференциации и кинетики, когда конкретные панели^{маркерных генов рассматриваются 2,3.}

Один из этих методов включает в себя ингибирование контакта кератиноцитов и истощение факторов роста в среде^{культуры 8.} Было показано, что кератиноциты могут дифференцироваться спонтанно, когда клетки достигают полной плотности.  Исключение факторов роста в среде культуры может еще больше усилить дифференциацию. Метод объединения ингибирования контакта и истощения факторов роста было показано для создания дифференцированных кератиноцитов с генными экспрессионными моделями, похожими на нормальный стратифицированный эпидермис при использовании нескольких эпидермальных^{маркеров 3}, предполагая, что эта модель подходит для изучения нормальной дифференциации кератиноцитов. Недавно, два всеобъемлющих анализа экспрессии генов дифференциации кератиноцитов с помощью этой модели были^{зарегистрированы 9,10}. Исследователи проверили эту модель на молекулярном уровне и показали, что она может быть использована для изучения нормальной и больной дифференциации кератиноцитов.

Этот протокол описывает процедуру метода дифференциации in vitro и молекулярного анализа дифференцированных клеток с использованием РНК-сек. Он также иллюстрирует характеристику транскриптома клеток на день дифференциации 0 (стадия распространения), день 2, день 4 и день 7 (ранняя, средняя и поздняя дифференциация, соответственно). Показано, что дифференцированные кератиноциты отображают модели экспрессии генов, которые во многом напоминают клетки во время эпидермального расслоения. Чтобы изучить, может ли этот метод быть использован для изучения патологии кожи, мы применили тот же экспериментальный и анализ трубопровода для исследования кератиноцитов проведения мутаций транскрипционного фактора p63, которые являются производными от пациентов с эктродактически, эктодермальной дисплазии и расщелины губы / неба (EEC)^{синдром 11,12}. Этот протокол фокусируется на дифференциации кератиноцитов в пробирке, а также последующем биоинформатическое анализ РНК-сек. Другие шаги в полной процедуре, такие как экстракция РНК, подготовка образца РНК-сек и строительство библиотеки, хорошо документированы и могут быть легко соблюдены, особенно при использовании многих широко используемых коммерческих комплектов. Таким образом, эти шаги лишь кратко описаны в протоколе. Данные показывают, что этот трубопровод подходит для изучения молекулярных явлений во время эпидермальной дифференциации в здоровых и больных кератиноцитах.