Charakterisierung der In-Vitro-Differenzierung menschlicher Primärkeratinozyten durch RNA-Seq-Analyse
Summary
Hier wird ein schrittweises Verfahren zur In-vitro-Differenzierung menschlicher Primärkeratinozyten durch Kontakthemmung dargestellt, gefolgt von einer Charakterisierung auf molekularer Ebene durch RNA-seq-Analyse.
Abstract
Humane primäre Keratinozyten werden oft als In-vitro-Modelle für Studien über epidermale Differenzierung und verwandte Krankheiten verwendet. Es wurden Methoden zur In-vitro-Differenzierung von Keratinozyten berichtet, die in zweidimensionalen (2D) untergetauchten Weisen unter Verwendung verschiedener Induktionsbedingungen kultiviert wurden. Hier wird ein Verfahren zur 2D-In-vitro-Keratinozytendifferenzierungsmethode durch Kontaktinhibition und anschließende molekulare Charakterisierung durch RNA-seq beschrieben. Kurz gesagt, Keratinozyten werden in definierten Keratinozyten Medium mit Wachstumsfaktoren ergänzt, bis sie vollständig konfluent sind angebaut. Die Differenzierung wird durch enge Kontakte zwischen den Keratinozyten induziert und durch den Ausschluss von Wachstumsfaktoren im Medium weiter stimuliert. Anhand von RNA-Seq-Analysen wird gezeigt, dass beide 1) differenzierten Keratinozyten während der Differenzierung unterschiedliche molekulare Signaturen aufweisen und 2) das dynamische Genexpressionsmuster bei der epidermalen Schichtung weitgehend Zellen ähnelt. Was den Vergleich mit der normalen Keratinozytendifferenzierung betrifft, so weisen Keratinozyten, die Mutationen des Transkriptionsfaktors p63 tragen, veränderte Morphologie und molekulare Signaturen auf, die mit ihren Differenzierungsfehlern übereinstimmen. Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll die Schritte zur 2D-In-vitro-Keratinozytendifferenzierung und deren molekulare Charakterisierung, wobei der Schwerpunkt auf der bioinformatischen Analyse von RNA-seq-Daten liegt. Da die RNA-Extraktion und die RNA-Seq-Verfahren gut dokumentiert sind, steht dieses Protokoll nicht im Mittelpunkt. Das experimentelle Verfahren der In-vitro-Keratinozytendifferenzierung und bioinformatischen Analyse-Pipeline kann verwendet werden, um molekulare Ereignisse während der epidermalen Differenzierung in gesunden und kranken Keratinozyten zu untersuchen.
Introduction
Menschliche primäre Keratinozyten, die von der menschlichen Haut abgeleitet werden, werden oft als zelluläres Modell verwendet, um die Biologie der Epidermis1,2,3,4zu studieren. Die Schichtung der Epidermis kann durch Keratinozytendifferenzierung modelliert werden, entweder in 2D-Unterschicht-Manier oder 3D-Luftlift-Organotypikmodell2,3,5,6,7. Obwohl 3D-Modelle für die Bewertung der epidermalen Struktur und Funktion immer wichtiger geworden sind, sind 2D-Differenzierungsmodelle aufgrund ihrer Bequemlichkeit und der Möglichkeit, eine große Anzahl von Zellen für Analysen zu generieren, immer noch weit verbreitet.
Verschiedene Bedingungen wurden angewendet, um Keratinozytendifferenzierung in 2D zu induzieren, einschließlich Zugabe von Serum, hoher Kalziumkonzentration, niedrigerer Temperatur und Hemmung der epidermalen Wachstumsfaktorrezeptoren2,3. Jede dieser Methoden wurde durch eine Reihe von Keratinozyten-Differenzierungsmarkergenen validiert und erwies sich als wirksam bei der Beurteilung der Keratinozytendifferenzierung, auch unter pathologischen Bedingungen. Diese Induktionsbedingungen zeigen jedoch auch Unterschiede in ihrer Differenzierungseffizienz und Kinetik, wenn bestimmte Panels von Markergenen untersucht werden2,3.
Eine dieser Methoden beinhaltet Keratinozytenkontakthemmung und Erschöpfung der Wachstumsfaktoren im Kulturmedium8. Es hat sich gezeigt, dass Keratinozyten spontan unterscheiden können, wenn Zellen die volle Dichte erreichen. Der Ausschluss von Wachstumsfaktoren im Kulturmedium kann die Differenzierung weiter verstärken. Die Methode, die Kontakthemmung und erschöpfende Wachstumsfaktoren kombiniert, hat gezeigt, dass sie differenzierte Keratinozyten mit Genexpressionsmustern erzeugt, die der normalen geschichteten Epidermis ähneln, wenn mehrere epidermale Marker verwendet werden3, was darauf hindeutet, dass dieses Modell für die Untersuchung der normalen Keratinozytendifferenzierung geeignet ist. Kürzlich wurden zwei umfassende Genexpressionsanalysen der Keratinozytendifferenzierung mit diesem Modell9,10berichtet. Die Forscher validierten dieses Modell auf molekularer Ebene und zeigten, dass es verwendet werden kann, um normale und kranke Keratinozytendifferenzierung zu untersuchen.
Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur In-vitro-Differenzierungsmethode und molekularen Analyse differenzierter Zellen mit RNA-seq. Es veranschaulicht auch die Charakterisierung des Transkriptoms der Zellen am Differenzierungstag 0 (Proliferationsstadium), Tag 2, Tag 4 und Tag 7 (frühe, mittlere bzw. späte Differenzierung). Es wird gezeigt, dass differenzierte Keratinozyten Genexpressionsmuster aufweisen, die Zellen während der epidermalen Schichtung weitgehend ähneln. Um zu untersuchen, ob diese Methode für die Untersuchung der Hautpathologie verwendet werden kann, haben wir dieselbe experimentelle und Analyse-Pipeline eingesetzt, um Keratinozyten zu untersuchen, die Mutationen des Transkriptionsfaktors p63 tragen, die von Patienten mit ektokaktischer, ektodermaler Displasie und Lip-Palate-Syndrom (EEC) abgeleitet werden11,12. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die In-vitro-Differenzierung von Keratinozyten sowie die anschließende bioinformatische Analyse von RNA-seq. Andere Schritte des gesamten Verfahrens wie RNA-Extraktion, RNA-seq Probenvorbereitung und Bibliotheksbau sind gut dokumentiert und können leicht befolgt werden, insbesondere bei verwendung samt vielen häufig verwendeten kommerziellen Kits. Daher werden diese Schritte nur kurz im Protokoll beschrieben. Die Daten zeigen, dass diese Pipeline für die Untersuchung molekularer Ereignisse während der epidermalen Differenzierung in gesunden und kranken Keratinozyten geeignet ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Induktion der menschlichen Keratinozytendifferenzierung und anschließenden Charakterisierung mittels RNA-Seq-Analysen. In der aktuellen Literatur verwenden viele Studien zur Unterscheidung der menschlichen Keratinozyten zwei andere Methoden, mit einer hohen Kalziumkonzentration oder mit Serum als Methoden zur Differenzierung2,3,23. Ein früherer Bericht verglich diese drei verschiedenen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) unterstützt. (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Stipendium der Radboud University (H.Z.); und Stipendium des Chinesischen Stipendienrates 201406330059 (J.Q.).
Materials
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2929BA | |
| Bovine pituitary extract (BPE) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| CFX96 Real-Time system | Bio-Rad | qPCR machine | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Ethanolamine >= 98% | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| High Sensitivity DNA chips | Agilent | 5067-4626 | |
| Hydrocortison | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Insulin | Lonza | Part of the bulletKit | |
| iQ SYBR Green Kit | BioRad | 170-8886 | |
| iScript cDNA synthesis | Bio rad | 1708890 | |
| KAPA Library Quant Kit | Roche | 07960255001 | Low concentration measure kit |
| KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase | Roche | KK8540 | RNAseq kit |
| KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Nanodrop | deNovix | DS-11 FX (model) | Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements |
| NEXTflex DNA barcodes -24 | Illumnia | NOVA-514103 | 6 bp long primers |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 |
References
- Hardman, J. A. Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease. British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).
- Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control. PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).
- Van Ruissen, F., et al. Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures. Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).
- Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
- Ali, N., et al. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
- Luis, N. M., et al. Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4. Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).
- Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).
- Poumay, Y., Pittelkow, M. R. Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins. Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).
- Kouwenhoven, E. N., et al. Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation. EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).
- Qu, J., et al. Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape. Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).
- Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. The p63 gene in EEC and other syndromes. Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).
- Browne, G., et al. Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias. Journal of Cell Science. 124, 2200-2207 (2011).
- . KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Available from: https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit (2019)
- Doyle, K. a. M. . Protocols and applications guide. , (1996).
- . Hyperprep Kit Available from: https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html (2019)
- . TrimGalore Available from: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore (2019)
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- . Convert chromosome names in a bigWig file Available from: https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721 (2019)
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
- Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
- Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).
- Mullegama, S. V., et al. Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
- Ma, F., et al. A comparison between whole transcript and 3′ RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods. BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).
- Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
- Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
- Oyola, S. O., et al. Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes. BMC Genomics. 13, 1 (2012).
- Quail, M. A., et al. Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries. Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
- Ross, M. G., et al. Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).
- . ARMOR Available from: https://github.com/csoneson/ARMOR (2019)
- . snakemake-workflows Available from: https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows (2019)
