Summary

RNA-Seq解析によるヒト原発性角化細胞のインビトロ分化の特徴

Published: May 16, 2020
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Summary

ここで提示されるヒト一次角化細胞のインビトロ分化法は、RNA-seq分析による分子レベルでの特徴付けによる接触阻害による。

Abstract

ヒトの原発性角化細胞は、表皮分化および関連疾患に関する研究のためのインビトロモデルとしてしばしば使用される。種々の誘導条件を用いて2次元(2D)水没式で培養したケラチノサイトのインビトロ分化に関する方法が報告されている。ここで説明する、RNA-seqによる接触阻害およびその後の分子特性化による2Dインビトロケラチノサイト分化法の手順について説明する。簡単に言えば, ケラチノサイトは、それらが完全にコンフルエントになるまで成長因子を補充定義されたケラチノサイト培地で成長します。.分化は、ケラチノサイト間の密接な接触によって誘導され、培地中の成長因子を除外することによってさらに刺激される。RNA-seq分析を用いて、1)分化された角化細胞の両方が分化中に異なる分子シグネチャを示し、2)動的遺伝子発現パターンは表皮層構造中の細胞に大きく似ていることが示される。正常なケラチノサイト分化との比較については、転写因子p63の変異を運ぶ角化細胞は、それらの分化欠陥と一致する変化した形態および分子シグネチャを示す。結論として、このプロトコルはRNA-seqデータのバイオインフォマティクス分析に重点を置いて、2D in vitroケラチノサイト分化とその分子特性解析のステップを詳述する。RNA抽出およびRNA-seqの手順は十分に文書化されているので、このプロトコルの焦点ではありません。in vitroケラチノサイト分化およびバイオインインフォマティクス分析パイプラインの実験手順は、健康で病気のケラチノサイトにおける表皮分化中の分子事象を研究するために使用することができる。

Introduction

ヒト皮膚由来のヒト原発性角化細胞は、表1、2、3、4の生物学を研究する細胞モデルとしてしばしば用いられる。表皮の層は、ケラチノサイト分化法により、2D水没単層法または3Dエアリフトオルガノツモデル2、3、5、6、7のいずれかでモデル化することができる。表皮の構造や機能を評価するために3Dモデルがますます重要になってきていますが、2D分化モデルは、その利便性と分析のために多数の細胞を生成する可能性のために、まだ広く使用されています。

血清の添加、カルシウムの高濃度、表皮成長因子受容体2、3の低温および阻害を含む、2Dにおけるケラチノサイト分化を誘導するために様々な条件が適用されている。これらの各方法は、ケラチノサイト分化マーカー遺伝子の数によって検証されており、病理学的条件下を含むケラチノサイト分化の評価に有効であることが示されている。しかし、これらの誘導条件は、マーカー遺伝子の特定のパネルを2,3に調べた場合の分化効率と運動学の違いも示す。

これらの方法の1つは、培養培地8におけるケラチノサイト接触阻害および成長因子の枯渇を含む。細胞が完全な密度に達すると、ケラチノサイトが自発的に分化することが示されています。 培養培地中の成長因子を除くと、さらに分化を増強することができる。接触阻害と枯渇成長因子を組み合わせた方法は、いくつかの表皮マーカー3を用いた場合に、通常の表皮に類似した遺伝子発現パターンを有する分化ケラチノサイトを生成することが示されており、このモデルは正常なケラチノサイト分化の研究に適していることを示唆している。最近、このモデルを用いたケラチノサイト分化の2つの包括的な遺伝子発現解析が9,10に報告されている。研究者は、分子レベルでこのモデルを検証し、それが正常および病気のケラチノサイト分化を研究するために使用できることを示しました.

本プロトコルは、RNA-seqを用いた分化細胞のインビトロ分化法および分子解析の手順を説明する。また、分化0日目(増殖段階)、2日目、4日目、7日目(早期、中間、後期分化)における細胞の転写物の特徴を示す図である。分化された角化細胞は、表皮層の間に細胞に大きく似た遺伝子発現パターンを示す。この方法が皮膚病理の研究に使用できるかどうかを調べるために、同じ実験および分析パイプラインを適用して、眼球、外胚葉異形成および口唇口蓋裂症候群11、12を有する患者に由来する転写因子p63の突然変異を運ぶ角化細胞を調査した。このプロトコルは、ケラチノサイトのインビトロ分化と、RNA-seqのその後のバイオインフォマティクス解析に焦点を当てています。RNA抽出、RNA-seqサンプル調製、ライブラリ構築などの完全な手順の他のステップは、十分に文書化されており、特に多くの一般的に使用される商用キットを使用する場合に簡単に従うことができます。したがって、これらの手順はプロトコルで簡単に説明するだけです。このデータは、このパイプラインが健康で病気のケラチノサイトにおける表皮分化中の分子事象を研究するのに適していることを示している。

Protocol

皮膚生検は、健常なボランティアまたはp63突然変異を有する患者の幹から採取し、主要な角化細胞培養を設定した。ヒトの主要なケラチノサイトの確立に関するすべての手順は、ラドボウド大学ナイメーヘン医療センターの倫理委員会によって承認されました(「コミッシー・メンスゲボンデン・オンデルゾーク・アーネム・ナイメーヘン」)。インフォームドコンセントを取得しました。 …

Representative Results

正常ケラチノサイト分化とRNA-seq分析本実験では、5個体由来のケラチノサイト線を分化およびRNA-seq解析に用いた。図1は、分化およびRNA-seq分析結果の実験手順を要約した。分化中の正常な角化細胞および細胞形態変化のin vitro分化手順の概要を図1Aに示す。主成分分析(PCA)は、分化を行っているケラチノサイトが、全般的な遺伝子発?…

Discussion

本研究では、RNA-seq解析を用いてヒトケラチノサイト分化とその後の特性解析を誘導する方法について説明する。現在の文献では、ヒトケラチノサイト分化に関する多くの研究は、他の2つの方法を使用し、高カルシウム濃度または血清を用いて分化を誘導する方法として2、3、23。以前の報告では、これら3つの異なる方法<s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究はオランダ科学研究機構(NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010,H.Z.)によって支援されました。(NWO/ALW/オープンコンペティション/ALWOP 376、H.Z.、J.G.A.S.);ラドボウド大学フェローシップ(H.Z.);中国奨学金評議会助成金201406330059(J.Q.)

Materials

Bioanalyzer 2100 Agilent G2929BA
Bovine pituitary extract (BPE) Lonza Part of the bulletKit
CFX96 Real-Time system Bio-Rad qPCR machine
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8537
Epidermal Growth Factor (EGF) Lonza Part of the bulletKit
Ethanolamine >= 98% Sigma-Aldrich E9508
High Sensitivity DNA chips Agilent 5067-4626
Hydrocortison Lonza Part of the bulletKit
Insulin Lonza Part of the bulletKit
iQ SYBR Green Kit BioRad 170-8886
iScript cDNA synthesis Bio rad 1708890
KAPA Library Quant Kit Roche 07960255001 Low concentration measure kit
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase Roche KK8540 RNAseq kit
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Lonza 192060
Nanodrop deNovix DS-11 FX (model) Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements
NEXTflex DNA barcodes -24 Illumnia NOVA-514103 6 bp long primers
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
RNA Pico Chip Agilent 5067-1513

References

  1. Hardman, J. A. Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease. British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).
  2. Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control. PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).
  3. Van Ruissen, F., et al. Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures. Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).
  4. Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
  5. Ali, N., et al. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
  6. Luis, N. M., et al. Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4. Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).
  7. Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).
  8. Poumay, Y., Pittelkow, M. R. Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins. Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).
  9. Kouwenhoven, E. N., et al. Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation. EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).
  10. Qu, J., et al. Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape. Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).
  11. Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. The p63 gene in EEC and other syndromes. Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).
  12. Browne, G., et al. Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias. Journal of Cell Science. 124, 2200-2207 (2011).
  13. . KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Available from: https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit (2019)
  14. Doyle, K. a. M. . Protocols and applications guide. , (1996).
  15. . Hyperprep Kit Available from: https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html (2019)
  16. . TrimGalore Available from: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore (2019)
  17. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. . Convert chromosome names in a bigWig file Available from: https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721 (2019)
  20. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
  21. Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
  22. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
  23. Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).
  24. Mullegama, S. V., et al. Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
  25. Ma, F., et al. A comparison between whole transcript and 3′ RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods. BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).
  26. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
  27. Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).
  28. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
  29. Oyola, S. O., et al. Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes. BMC Genomics. 13, 1 (2012).
  30. Quail, M. A., et al. Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries. Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).
  31. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
  32. Ross, M. G., et al. Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).
  33. . ARMOR Available from: https://github.com/csoneson/ARMOR (2019)
  34. . snakemake-workflows Available from: https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows (2019)

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Cite This Article
Smits, J. G., Qu, J., Niehues, H., Zhou, H. Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis. J. Vis. Exp. (159), e60905, doi:10.3791/60905 (2020).

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