אפיון של בידול במבחנה של Keratinocytes האדם העיקרי על ידי ניתוח RNA-Seq
Summary
מוצג כאן הוא הליך צעד צעד עבור הבידול במבחנה של keratinocytes האדם העיקרי על ידי עיכוב מגע ואחריו אפיון ברמה המולקולרית על ידי ניתוח RNA-seq.
Abstract
keratinocytes האדם העיקרי משמשים לעתים קרובות כמו מודלים חוץית עבור מחקרים על בידול אפידרמיס ומחלות קשורות. שיטות דווחו עבור בידול במבחנה של keratinocytes תרבות דו מימדי (2D) נימוסים שקועים באמצעות תנאי אינדוקציה שונים. מתואר כאן הוא הליך עבור 2D בשיטת בידול קרבינוציט במבחנה על ידי עיכוב מגע ואפיון מולקולרי הבאים על ידי RNA-seq. בקצרה, keratinocytes גדלים במדיום keratinocyte מוגדר בתוספת עם גורמי גדילה עד שהם confluent באופן מלא. בידול מושרה על ידי מגעים קרובים בין keratinocytes מגורה עוד יותר על ידי הוצאת גורמי גדילה במדיום. באמצעות ניתוחי RNA-seq, הוא מוצג כי שניהם 1) keratinocytes מובדל להפגין חתימות מולקולריות נפרדות במהלך בידול ו 2) דפוס ביטוי גנים דינמי דומה במידה רבה תאים במהלך ריבוד אפידרמיס. באשר להשוואה להבדיל keratinocyte נורמלי, keratinocytes נושא מוטציות של גורם שעתוק p63 התערוכה מורפולוגיה שונה וחתימות מולקולריות, עולה בקנה אחד עם פגמי הבידול שלהם. לסיכום, פרוטוקול זה מפרט את השלבים עבור בידול 2D במבחנה keratinocyte ואת האפיון המולקולרי שלה, עם דגש על ניתוח ביואינפורמטיק של נתוני RNA-seq. מכיוון שהליכי החילוץ וה-RNA-seq תועדו היטב, אין זה המוקד של פרוטוקול זה. ההליך הניסיוני של בידול קרבטינוציט במבחנה וצינור ניתוח ביואינופורמטי יכול לשמש כדי ללמוד אירועים מולקולריים במהלך בידול אפידרמיס ב keratinocytes בריא וחולה.
Introduction
keratinocytes האדם העיקרי נגזר העור האנושי משמשים לעתים קרובות כמודל סלולרי כדי ללמוד את הביולוגיה שלהאפידרמיס 1,2,3,4. השכבות של האפידרמיס יכול להיות מודל על ידי בידול keratinocyte, או באופן מונודאלי שקוע 2D או 3D אוויר הרמת organotypic מודל2,3,5,6,7. למרות מודלים 3D הפכו חשובים יותר ויותר כדי להעריך את המבנה האפידרמי ואת הפונקציה, מודלים בידול 2D עדיין בשימוש נרחב, בשל הנוחות שלהם ואת האפשרות ליצור מספר גדול של תאים לניתוחים.
תנאים שונים הוחלו על גורם בידול keratinocyte ב 2D, כולל תוספת של סרום, ריכוז גבוה של סידן, טמפרטורה נמוכה יותר ועיכוב של קולטני גורם גדילהאפידרמיס 2,3. כל אחת משיטות אלה אומתה על ידי מספר גנים סמן בידול keratinocyte והוצג להיות יעיל בהערכת בידול keratinocyte, כולל בתנאים פתולוגיים. עם זאת, תנאי אינדוקציה אלה גם מראים הבדלים ביעילות ההבידול שלהם קינטיקה כאשר לוחות ספציפיים שלגנים סמן נבחנים 2,3.
אחת השיטות האלה כרוכה עיכוב מגע keratinocyte ודלדול של גורמי גדילה במדיום התרבות8. זה כבר הראה כי keratinocytes יכול להבדיל באופן ספונטני כאשר תאים מגיעים לצפיפות מלאה. לא כולל גורמי גדילה במדיום התרבות יכול לשפר עוד יותר את ההבידול. השיטה המשלבת עיכוב מגע ומרוקן גורמי גדילה כבר הראו לייצר keratinocytes מובדיל עם דפוסי ביטוי גנים דומים אפידרמיס מרובד נורמלי בעת שימוש במספר סמניםאפידרמיס 3, המצביע על כך מודל זה מתאים ללימוד בידול keratinocyte נורמלי. לאחרונה, שני ניתוחי ביטוי גנים מקיפים של בידול keratinocyte באמצעות מודל זהדווחו 9,10. החוקרים אימתו מודל זה ברמה המולקולרית והראו כי ניתן להשתמש בו כדי ללמוד בידול קרטינוציט נורמלי וחולה.
פרוטוקול זה מתאר את ההליך עבור שיטת הבידול במבחנה וניתוח מולקולרי של תאים מובדילים באמצעות RNA-seq. היא גם ממחישה את האפיון של התמלילים של תאים ביום הבידול 0 (שלב ההתפשטות), היום השני, היום 4 ויום 7 (מוקדם, אמצע, ואיחור בבידול, בהתאמה). הוא מוצג כי keratinocytes מובדיל להציג דפוסי ביטוי גנים הדומים במידה רבה לתאים במהלך ריבוד אפידרמיס. כדי לבחון אם שיטה זו יכולה לשמש לחקר פתולוגיה של העור, יינו את אותו צינור ניסיוני וניתוח לחקור keratinocytes נושא מוטציות של גורם שעתוק p63 הנגזרים מחולים עם ectrodactyly, דיספלזיה אקטודרמלית ושסוע שפה / חיך (EEC)תסמונת 11,12. פרוטוקול זה מתמקד בבידול המבחנה של keratinocytes, כמו גם ניתוח ביואינפורמטיק עוקבות של RNA-seq. שלבים אחרים בהליך המלא כגון חילוץ RNA, הכנת מדגם RNA-seq ובניית ספרייה, מתועדים היטב ותועדים בקלות, במיוחד בעת שימוש ערכות מסחריות נפוצות רבות. לכן, שלבים אלה מתוארים לזמן קצר בלבד בפרוטוקול. הנתונים מראים כי צינור זה מתאים לחקר אירועים מולקולריים במהלך בידול אפידרמיס בkeratinocytes בריא וחולה.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבודה זו מתארת שיטה לגרימת בידול keratinocyte אנושי ואפיון עוקב באמצעות ניתוחי RNA-seq. בספרות הנוכחית, מחקרים רבים על בידול keratinocyte האנושי להשתמש בשתי שיטות אחרות, עם ריכוז סידן גבוה או עם סרום כשיטותכדי לגרום בידול 2,3,23. דו”ח קודם השווה בזהירות שלו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO / ALW / תחרות פתוחה / ALWOP 376, ה.ז., J.G.A.S.); מלגת אוניברסיטת רדבוד (ה.ת); ומענק מועצת המלגות הסינית 201406330059 (J.Q.).
Materials
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2929BA | |
| Bovine pituitary extract (BPE) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| CFX96 Real-Time system | Bio-Rad | qPCR machine | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Ethanolamine >= 98% | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| High Sensitivity DNA chips | Agilent | 5067-4626 | |
| Hydrocortison | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Insulin | Lonza | Part of the bulletKit | |
| iQ SYBR Green Kit | BioRad | 170-8886 | |
| iScript cDNA synthesis | Bio rad | 1708890 | |
| KAPA Library Quant Kit | Roche | 07960255001 | Low concentration measure kit |
| KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase | Roche | KK8540 | RNAseq kit |
| KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Nanodrop | deNovix | DS-11 FX (model) | Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements |
| NEXTflex DNA barcodes -24 | Illumnia | NOVA-514103 | 6 bp long primers |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 |
References
- Hardman, J. A. Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease. British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).
- Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control. PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).
- Van Ruissen, F., et al. Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures. Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).
- Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
- Ali, N., et al. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
- Luis, N. M., et al. Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4. Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).
- Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).
- Poumay, Y., Pittelkow, M. R. Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins. Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).
- Kouwenhoven, E. N., et al. Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation. EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).
- Qu, J., et al. Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape. Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).
- Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. The p63 gene in EEC and other syndromes. Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).
- Browne, G., et al. Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias. Journal of Cell Science. 124, 2200-2207 (2011).
- . KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Available from: https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit (2019)
- Doyle, K. a. M. . Protocols and applications guide. , (1996).
- . Hyperprep Kit Available from: https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html (2019)
- . TrimGalore Available from: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore (2019)
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- . Convert chromosome names in a bigWig file Available from: https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721 (2019)
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
- Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
- Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).
- Mullegama, S. V., et al. Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
- Ma, F., et al. A comparison between whole transcript and 3′ RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods. BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).
- Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
- Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
- Oyola, S. O., et al. Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes. BMC Genomics. 13, 1 (2012).
- Quail, M. A., et al. Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries. Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
- Ross, M. G., et al. Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).
- . ARMOR Available from: https://github.com/csoneson/ARMOR (2019)
- . snakemake-workflows Available from: https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows (2019)
