Summary

Caractérisation de la différenciation in vitro des kératinocytes primaires humains par analyse ARN-Seq

Published: May 16, 2020
doi:

Summary

Présenté ici est une procédure stepwise pour la différenciation in vitro des kératinocytes primaires humains par inhibition de contact suivie de la caractérisation au niveau moléculaire par l’analyse d’ARN-seq.

Abstract

Les kératinocytes primaires humains sont souvent utilisés comme modèles in vitro pour des études sur la différenciation épidermique et les maladies connexes. Des méthodes ont été rapportées pour la différenciation in vitro des kératinocytes cultivés dans les manières submergées bidimensionnelles (2D) utilisant diverses conditions d’induction. Décrit ici est une procédure pour la méthode de différenciation in vitro de kératinocyte 2D par inhibition de contact et caractérisation moléculaire suivante par ARN-seq. En bref, les kératinocytes sont cultivés dans le milieu défini de kératinocyte complété avec des facteurs de croissance jusqu’à ce qu’ils soient entièrement confluents. La différenciation est induite par des contacts étroits entre les kératinocytes et encore stimulée par l’exclusion des facteurs de croissance dans le milieu. À l’aide d’analyses ARN-seq, il est démontré que les deux 1) kératinocytes différenciés présentent des signatures moléculaires distinctes lors de la différenciation et 2) le modèle dynamique d’expression des gènes ressemble en grande partie aux cellules pendant la stratification épidermique. En ce qui concerne la comparaison à la différenciation normale des kératinocytes, les kératinocytes porteurs de mutations du facteur de transcription p63 présentent une morphologie altérée et des signatures moléculaires, compatibles avec leurs défauts de différenciation. En conclusion, ce protocole détaille les étapes de la différenciation in vitro des kératinocytes 2D et de sa caractérisation moléculaire, en mettant l’accent sur l’analyse bioinformatique des données arn-seq. Étant donné que l’extraction de l’ARN et les procédures ARN-seq ont été bien documentées, ce n’est pas l’objet de ce protocole. La procédure expérimentale de différenciation in vitro des kératinocytes et du pipeline d’analyse bioinformatique peut être utilisée pour étudier les événements moléculaires lors de la différenciation épidermique chez les kératinocytes sains et maladies.

Introduction

Les kératinocytes primaires humains dérivés de la peau humaine sont souvent utilisés comme modèle cellulaire pour étudier la biologie de l’épiderme1,2,3,4. La stratification de l’épiderme peut être modélisée par différenciation des kératinocytes, soit d’une manière monocouche immergée en 2D, soit par le modèle organotypique 3D de levage d’air2,3,5,6,7. Bien que les modèles 3D soient devenus de plus en plus importants pour évaluer la structure et la fonction épidermiques, les modèles de différenciation 2D sont encore largement utilisés, en raison de leur commodité et de la possibilité de générer un grand nombre de cellules pour les analyses.

Diverses conditions ont été appliquées pour induire la différenciation des kératinocytes en 2D, y compris l’ajout de sérum, une forte concentration de calcium, une température plus basse et l’inhibition des récepteurs du facteur de croissance épidermique2,3. Chacune de ces méthodes a été validée par un certain nombre de gènes marqueurs de différenciation des kératinocytes et s’est montrée efficace dans l’évaluation de la différenciation des kératinocytes, y compris dans des conditions pathologiques. Cependant, ces conditions d’induction montrent également des différences dans leur efficacité de différenciation et cinétique lorsque des panneaux spécifiques de gènes marqueurssont examinés 2,3.

Une de ces méthodes implique l’inhibition de contact de kératinocyte et l’épuisement des facteurs de croissance dans le milieu de culture8. Il a été démontré que les kératinocytes peuvent se différencier spontanément lorsque les cellules atteignent leur pleine densité.  L’exclusion des facteurs de croissance dans le milieu culturel peut encore améliorer la différenciation. La méthode combinant l’inhibition de contact et les facteurs de croissance appauvrissants a été montrée pour générer des kératinocytes différenciés avec des modèles d’expression de gène semblables à l’épiderme stratifié normal en utilisant plusieurs marqueurs épidermiques3,suggérant que ce modèle est approprié pour étudier la différenciation normale de kératinocyte. Récemment, deux analyses complètes d’expression génétique de la différenciation des kératinocytes à l’aide dece modèle ont été rapportées 9,10. Les chercheurs ont validé ce modèle au niveau moléculaire et ont montré qu’il peut être utilisé pour étudier la différenciation normale et maladie des kératinocytes.

Ce protocole décrit la procédure pour la méthode de différenciation in vitro et l’analyse moléculaire des cellules différenciées utilisant l’ARN-seq. Il illustre également la caractérisation du transcriptome des cellules le jour de différenciation 0 (stade de prolifération), le jour 2, le jour 4 et le jour 7 (différenciation précoce, moyenne et tardive, respectivement). Il est démontré que les kératinocytes différenciés affichent des modèles d’expression génétique qui ressemblent en grande partie à des cellules pendant la stratification épidermique. Pour examiner si cette méthode peut être employée pour étudier la pathologie de peau, nous avons appliqué le même pipeline expérimental et d’analyse pour étudier des keratinocytes portant des mutations du facteur de transcription p63 qui sont dérivés des patients présentant ectrodactyly, displasie ectodermale et cleft lip/palate (EEC) syndrome11,12. Ce protocole se concentre sur la différenciation in vitro des kératinocytes ainsi que sur l’analyse bioinformatique subséquente de l’ARN-seq. D’autres étapes de la procédure complète, telles que l’extraction de l’ARN, la préparation de l’échantillon d’ARN-seq et la construction de bibliothèques, sont bien documentées et peuvent être facilement suivies, en particulier lors de l’utilisation de nombreux kits commerciaux couramment utilisés. Par conséquent, ces étapes ne sont décrites que brièvement dans le protocole. Les données montrent que ce pipeline est approprié pour étudier les événements moléculaires pendant la différenciation épidermique chez les kératinocytes sains et maladies.

Protocol

Des biopsies de peau ont été prises du tronc des volontaires en bonne santé ou des patients présentant des mutations de p63, pour établir la culture primaire de kératinocyte. Toutes les procédures concernant l’établissement des kératinocytes primaires humains ont été approuvées par le comité d’éthique du Centre médical de l’Université Radboud de Nimègue (« Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nimègue »). Un consentement éclairé a été obtenu. 1. Différenciation…

Representative Results

Différenciation normale des kératinocytes et analyse ARN-seqDans cette expérience, des lignées de kératinocytes dérivées de cinq individus ont été employées pour la différenciation et les analyses d’ARN-seq. La figure 1 résume la procédure expérimentale de différenciation et les résultats de l’analyse ARN-seq. La figure 1A illustre un aperçu des procédures de différenciation in vitro des kératinocytes normaux et des changements de morphologie cell…

Discussion

Ce travail décrit une méthode pour induire la différenciation humaine de kératinocyte et la caractérisation suivante utilisant des analyses d’ARN-seq. Dans la littérature actuelle, beaucoup d’études sur la différenciation humaine de kératinocyte emploient deux autres méthodes, avec une concentration élevée de calcium ou avec le sérum comme méthodes pour induire la différenciation2,3,23. Un rapport précédent …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été soutenue par l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Bourse de l’Université Radboud (H.Z.); et subvention du Conseil chinois des bourses d’études 201406330059 (J.Q.).

Materials

Bioanalyzer 2100 Agilent G2929BA
Bovine pituitary extract (BPE) Lonza Part of the bulletKit
CFX96 Real-Time system Bio-Rad qPCR machine
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8537
Epidermal Growth Factor (EGF) Lonza Part of the bulletKit
Ethanolamine >= 98% Sigma-Aldrich E9508
High Sensitivity DNA chips Agilent 5067-4626
Hydrocortison Lonza Part of the bulletKit
Insulin Lonza Part of the bulletKit
iQ SYBR Green Kit BioRad 170-8886
iScript cDNA synthesis Bio rad 1708890
KAPA Library Quant Kit Roche 07960255001 Low concentration measure kit
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase Roche KK8540 RNAseq kit
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Lonza 192060
Nanodrop deNovix DS-11 FX (model) Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements
NEXTflex DNA barcodes -24 Illumnia NOVA-514103 6 bp long primers
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
RNA Pico Chip Agilent 5067-1513

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Cite This Article
Smits, J. G., Qu, J., Niehues, H., Zhou, H. Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis. J. Vis. Exp. (159), e60905, doi:10.3791/60905 (2020).

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