توصيف التمايز في المختبر من خلايا الكيراتينوسيات الأولية البشرية بواسطة تحليل الحمض النووي الريبي-SEQ
Summary
هنا هو إجراء متدرج لتمايز في المختبر من keratinocytes الإنسان الأولية عن طريق تثبيط الاتصال تليها توصيف على المستوى الجزيئي من قبل تحليل الحمض النووي الريبي- seq.
Abstract
وغالبا ما تستخدم keratinocytes الإنسان الأولية ونماذج في المختبر للدراسات على التمايز البشرة والأمراض ذات الصلة. وقد تم الإبلاغ عن أساليب لتمايز في المختبر من keratinocytes المستزرعة في ثنائية الأبعاد (2D) آداب مغمورة باستخدام ظروف الحث المختلفة. هو موضح هنا هو إجراء ل2D في طريقة تمايز keratinocyte في المختبر عن طريق تثبيط الاتصال والتوصيف الجزيئي اللاحقة من قبل RNA-seq. باختصار, تزرع keratinocytes في تعريف keratinocyte المتوسطة تكملها عوامل النمو حتى تكون التقاء تماما. ويُستحث التمايز عن طريق الاتصالات الوثيقة بين الخلايا الكيراتينية ويُحفَّز كذلك باستبعاد عوامل النمو في الوسط. باستخدام التحليلات RNA-seq، يظهر أن كلا 1) keratinocytes متباينة المعرض التوقيعات الجزيئية متميزة أثناء التمايز و 2) نمط التعبير الجيني الديناميكي يشبه إلى حد كبير الخلايا خلال الطبقات البشرة. بالمقارنة مع التمايز keratinocyte العادي، keratinocytes تحمل طفرات من عامل النسخ p63 معرض تغيير مورفولوجيا والتوقيعات الجزيئية، بما يتفق مع عيوب التمايز الخاصة بهم. في الختام، هذا البروتوكول تفاصيل الخطوات ل2D في المختبر keratinocyte التمايز وتوصيف الجزيئية، مع التركيز على تحليل المعلوماتية الحيوية للبيانات RNA-seq. لأن RNA استخراج و RNA- إجراءات ني- ا موثقة جيدا، فإنه ليس محور هذا البروتوكول. الإجراء التجريبي للتمايز في الكيراتينوسيات في المختبر الحيوي وخط أنابيب تحليل المعلوماتية الحيوية يمكن استخدامها لدراسة الأحداث الجزيئية خلال التمايز الجلدي في خلايا الكيراتينوسيات صحية والمُرَضَّة.
Introduction
غالباً ما تستخدم keratinocytes الإنسان المشتقة من الجلد البشري كنموذج الخلوية لدراسة بيولوجيا البشرة1,2,3,4. يمكن أن تكون على غرار الطبقات من البشرة من قبل التمايز keratinocyte، إما في 2D مغمورة monolayer أزياء أو 3D الهواء رفع organotypic نموذج2،3،5،6،7. على الرغم من أن النماذج ثلاثية الأبعاد أصبحت ذات أهمية متزايدة لتقييم بنية الجلد ووظيفته ، فإن نماذج التمايز 2D لا تزال تستخدم على نطاق واسع ، بسبب راحتها وإمكانية توليد أعداد كبيرة من الخلايا للتحليلات.
وقد طبقت شروط مختلفة لحفز التمايز keratinocyte في 2D، بما في ذلك إضافة المصل، وارتفاع تركيز الكالسيوم، وانخفاض درجة الحرارة وتثبيط مستقبلات عامل النمو البشرة2،3. وقد تم التحقق من صحة كل من هذه الطرق من قبل عدد من الجينات علامة التمايز keratinocyte وتبين أن تكون فعالة في تقييم تمايز keratinocyte, بما في ذلك في ظل الظروف المرضية. ومع ذلك ، فإن هذه الظروف التعريفية تظهر أيضا اختلافات في كفاءة التمايز والحركية عند فحص لوحات محددة من الجينات علامة2،3.
واحدة من هذه الأساليب ينطوي keratinocyte منع الاتصال واستنفاد عوامل النمو في الثقافة المتوسطة8. وقد تبين أن الكيراتينوسيات يمكن أن تفرق تلقائيا عندما الخلايا تصل إلى كثافة كاملة. ويمكن أن يؤدي استبعاد عوامل النمو في الوسط الثقافي إلى زيادة تعزيز التمايز. وقد تبين أن الأسلوب الذي يجمع بين تثبيط الاتصال وعوامل النمو المستنفدة لتوليد خلايا الكيراتينوسيات المتمايزة مع أنماط التعبير الجيني مماثلة للبشرة الطبقية الطبيعية عند استخدام العديد من علامات البشرة3، مما يشير إلى أن هذا النموذج مناسب لدراسة تمايز الكيراتينوسيت العادي. في الآونة الأخيرة، تم الإبلاغ عن تحليلين شاملين للتعبير الجيني للتمايز الكيراتينوتي باستخدام هذا النموذج9،10. وقد قام الباحثون بالتحقق من صحة هذا النموذج على المستوى الجزيئي وأظهروا أنه يمكن استخدامه لدراسة تمايز الكيراتينوسيات العادي والمُرَض.
يصف هذا البروتوكول الإجراء الخاص بطريقة التمايز في المختبر والتحليل الجزيئي للخلايا المتمايزة باستخدام الحمض النووي الريبي الريبي-الصد. كما يوضح توصيف نسخة الخلايا في يوم التمايز 0 (مرحلة الانتشار)، واليوم 2، واليوم 4، واليوم السابع (التمايز المبكر والمتوسط والمتأخر على التوالي). وتبين أن الكيراتينوسيات المختلفة تعرض أنماط التعبير الجيني التي تشبه إلى حد كبير الخلايا أثناء التقسيم الطبقي البشرة. لدراسة ما إذا كان يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة أمراض الجلد، قمنا بتطبيق نفس خط الأنابيب التجريبية والتحليلية للتحقيق في keratinocytes تحمل طفرات من عامل النسخ p63 التي هي مستمدة من المرضى الذين يعانون من ectrodactyly، التفكيك وشقوق الشفة / الحنك متلازمة11،12. ويركز هذا البروتوكول على التمايز في المختبر من keratinocytes وكذلك التحليل الحيوي اللاحقة من الحمض النووي الريبي- سيك. خطوات أخرى في الإجراء الكامل مثل استخراج الحمض النووي الريبي، وإعداد عينة RNA-seq وبناء المكتبة، هي موثقة جيدا ويمكن اتباعها بسهولة، وخصوصا عند استخدام العديد من مجموعات تجارية شائعة الاستخدام. لذلك، يتم وصف هذه الخطوات باختصار فقط في البروتوكول. وتظهر البيانات أن هذا خط الأنابيب هو مناسبة لدراسة الأحداث الجزيئية خلال التمايز البشرة في الكيراتينوسيات صحية والمُرَكَّرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا العمل طريقة لحفز تمايز الكيراتينوسيت البشري والتوصيف اللاحق باستخدام تحليلات الحمض النووي الريبي الريبي. في الأدب الحالي، العديد من الدراسات على تمايز الكيراتينوسيت البشري استخدام طريقتين آخرين، مع تركيز الكالسيوم عالية أو مع المصل كأساليب للحث على التمايز2,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا البحث من قبل المنظمة الهولندية للبحث العلمي (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010، H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); زمالة جامعة رادبود (H.Z.); ومنحة مجلس المنح الدراسية الصينية 201406330059 (J.Q.).
Materials
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2929BA | |
| Bovine pituitary extract (BPE) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| CFX96 Real-Time system | Bio-Rad | qPCR machine | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Ethanolamine >= 98% | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| High Sensitivity DNA chips | Agilent | 5067-4626 | |
| Hydrocortison | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Insulin | Lonza | Part of the bulletKit | |
| iQ SYBR Green Kit | BioRad | 170-8886 | |
| iScript cDNA synthesis | Bio rad | 1708890 | |
| KAPA Library Quant Kit | Roche | 07960255001 | Low concentration measure kit |
| KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase | Roche | KK8540 | RNAseq kit |
| KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Nanodrop | deNovix | DS-11 FX (model) | Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements |
| NEXTflex DNA barcodes -24 | Illumnia | NOVA-514103 | 6 bp long primers |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 |
References
- Hardman, J. A. Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease. British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).
- Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control. PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).
- Van Ruissen, F., et al. Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures. Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).
- Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
- Ali, N., et al. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
- Luis, N. M., et al. Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4. Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).
- Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).
- Poumay, Y., Pittelkow, M. R. Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins. Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).
- Kouwenhoven, E. N., et al. Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation. EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).
- Qu, J., et al. Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape. Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).
- Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. The p63 gene in EEC and other syndromes. Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).
- Browne, G., et al. Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias. Journal of Cell Science. 124, 2200-2207 (2011).
- . KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Available from: https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit (2019)
- Doyle, K. a. M. . Protocols and applications guide. , (1996).
- . Hyperprep Kit Available from: https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html (2019)
- . TrimGalore Available from: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore (2019)
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- . Convert chromosome names in a bigWig file Available from: https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721 (2019)
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
- Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
- Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).
- Mullegama, S. V., et al. Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
- Ma, F., et al. A comparison between whole transcript and 3′ RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods. BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).
- Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
- Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
- Oyola, S. O., et al. Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes. BMC Genomics. 13, 1 (2012).
- Quail, M. A., et al. Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries. Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
- Ross, M. G., et al. Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).
- . ARMOR Available from: https://github.com/csoneson/ARMOR (2019)
- . snakemake-workflows Available from: https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows (2019)
