Cuantificación de la resistencia a los antibióticos mediada por plásmido en un enfoque de evolución experimental

1. Construcción de un plásmido modelo que lleve un gen de resistencia a los antibióticos NOTA: La cepa Escherichia coli K-12 MG1655 fue utilizada como organismo modelo en todos los experimentos (DSM No. 18039, Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, DSMZ). Durante la construcción del plásmido se utilizó la cepa E. coli DH5-17. PCR amplificar la columna vertebral plásmido de su elección y amplificar el gen de resistencia incluyendo la región promotora por PCR (Figura 1). PCR amplifica la columna vertebral del plásmido utilizando una polimerasa de alta fidelidad y los oligonucleótidos pBBR1_for (5′-GCGGCCACCGGCTCTCT-3′) y pBBR1_rev (5′-TACGCGCGCCAGCGTGACCC-3′) en la plantilla de plásmido pLC (GenBank acc. no. MH238456)18. PCR amplificar el gen de resistencia nptII incluyendo el promotor nativo Tn5 19 utilizando una polimerasa de alta fidelidad y oligonucleótidos nptII_gib_for (5′-GCGCCGCCCCCCCCCCCCCCTCCTTGAAGCTGCGCGcTGCCGCGCA-3′) y nptII_gib_rev (5′-CGGTCCCCGCCAAAACCCCATCCGTGGTACCGCACACACACACACA-3′). El gen nptII codifica para una fosfotransferasa de neomicina y confiere resistencia a la kanamicina.NOTA: Diseñe las imprimaciones para el gen de resistencia con aproximadamente 20 bp de secuencia complementaria a la columna vertebral del plásmido a la que se fusionará. Limpie ambos fragmentos de PCR con un kit de su elección. Unir el producto PCR del gen de resistencia a antibióticos purificados (incluida su región promotora) a la columna vertebral del plásmido purificado y fusionar las regiones homólogas utilizando el ensamblaje isotérmico20, a 50 oC durante 60 minutos. Electroportar el producto fusionado en la cepa E. coli DH5. Introducir 2 ml del producto desde el paso 1,3 hasta 40 l de células electrocompetentes en cubetas de 2 mm a 4 oC y 2,5 kV. Resuspender las células en 1 ml de caldo de lisógenia (LB) medio. Transfiera el volumen total a un tubo de microfúctelo e incuba1 h a 37 oC agitando a 250 rpm en un agitador orbital para permitir la expresión del marcador de resistencia en el plásmido. Placa 100 l de las células en placas de agar LB que contienen el antibiótico adecuado (kanamicina 25 g/ml) para seleccionar el gen de resistencia a los antibióticos y así seleccionar para las células portadoras de plásmido. Gire hacia abajo el resto, retire el sobrenadante, resuspenda las células en 100 l lb y placa en una placa de agar selectiva. Incubar las placas a 37oC durante 24 h. Para verificar los clones, extraiga los plásmidos construidos a través de la lisis alcalina utilizando un kit de mini-preparación comercial. Cosecha de 5 ml del cultivo nocturno estacionario centrifugando a 12.000 x g a temperatura ambiente. Resuspenda las células en la solución de resuspensión, luego lise y neutralice la solución celular. Centrífuga durante 5 min a 12.000 x g. Transfiera el sobrenadante a la columna de unión al ADN incluida en el kit y lave la columna dos veces con una centrifugadora de solución de lavado de 500 l 2 veces antes de eluir la membrana de la columna con tampón de elución. Realice la secuenciación de Sanger del plásmido para confirmar que la secuencia es correcta. Una vez verificada la validez del plásmido, electroporteeele el plásmido (ahora pCON) en la cepa E. coli MG1655 como se describió anteriormente. Esto produce cepa E. coli MG1655 pCON. 2. Monitoreo de bacterias portadoras de plásmidos bajo diversas condiciones a lo largo del tiempo NOTA: El experimento de evolución se lleva a cabo con cepas portadoras de plásmidos en condiciones no selectivas (medios LB) en dos temperaturas (37 oC y 20 oC) y tres tamaños de cuello de botella de población. El diseño experimental se utiliza para estudiar la persistencia plásmido bajo diversas condiciones. Diseño de un experimento de evolución para seguir la frecuencia del plásmido a lo largo del tiempo (Figura 2) Placar la cepa de plásmido construida(E. coli MG1655 pCON) en placas de agar LB suplementadas con antibióticos (kanamicina 25 g/ml) e incubar durante la noche a 37 oC. Prepare 96 placas de pozo profundo con 1 ml de medio LB en cada poca. Como ancestros bacterianos, recoger ocho colonias aisladas al azar de la placa de agar en pozos independientes. Incubar las placas a 37 oC y 450 rpm en una coctelera durante 24 h. Preparar un stock de glicerol congelado de los clones ancestrales. Al día siguiente transferir las ocho poblaciones de réplica en nuevas placas de pozo profundo de acuerdo con el diseño experimental (Figura 2). Los cultivos se diluyen 1:100 (cuello de botella grande, L), 1:1,000 (cuello de botella medio, M), o 1:10,000 (pequeño cuello de botella, S) en un volumen total de 1 ml LB usando PBS para la dilución. Los cultivos diluidos se incuban a 37 oC y 20 oC.NOTA: Es muy importante controlar la contaminación cruzada en la placa de 96 pocillos profundos. Por lo tanto, utilice un diseño de placa de tablero de ajedrez intercalando pozos inoculados con medio LB libre de bacterias. Utilice este patrón a través de todo el experimento de evolución. Los cultivos incubados a 37oC se transfieren cada 12 h, mientras que los cultivos a 20oC se transfieren cada 24 h.NOTA: Durante cada evento de transferencia se aplica el tratamiento de tamaño del cuello de botella y la transferencia en serie se repite en un total de 98 transferencias. El número de transferencias dependerá del diseño experimental de los lectores. Preparar una población de glicerol congelado de todas las poblaciones regularmente, 2 veces a la semana. Supervisión de la frecuencia del plásmido mediante chapado de réplica (Figura 3)NOTA: Durante el experimento de evolución, la frecuencia de las células portadoras de plásmidos en la población se estima a partir de la proporción de huéspedes. El protocolo de chapado de réplica se muestra en la Figura 3. Para determinar la frecuencia de plásmido en la población durante el experimento de evolución, los cultivos estacionarios se diluyen en serie y se chapan en placas de agar LB no selectivas. Ajuste la dilución según un rendimiento de 250-500 colonias por placa.NOTA: Prepare placas de agar LB gruesas antes del revestimiento (agar de 30 ml). Las poblaciones chapadas son incubadas para el crecimiento nocturno de acuerdo con su temperatura de crecimiento en el experimento.NOTA: Las colonias deben ser pequeñas, por lo tanto incuban <24 h a 37 oC. Después del crecimiento nocturno, cuente todas las colonias utilizando una estación de recuento manual o automatizada de colonias y calcule el tamaño total de la población bacteriana en los cultivos.NOTA: Las colonias en el borde de la placa de agar no deben incluirse en el recuento total de células bacterianas. Esterilice las piezas cuadradas (20 x 20 cm) de terciopelo de algodón mediante autoclave.NOTA: El paño de terciopelo debe ser 100% algodón para ser autoclavable. Es importante secar el paño después de la esterilización. Después de la esterilización del paño de terciopelo, coloque el paño en un bloque redondo y fíjelo con un anillo de metal. Es crucial evitar las arrugas. Coloque cuidadosamente el plato con las colonias cultivadas (agar mirando hacia abajo) en la superficie fija del paño de terciopelo. Asegúrese de que todas las colonias toquen la superficie de terciopelo tocando cuidadosamente el plato Petri de una manera circular. Retire cuidadosamente la placa de agar LB y coloque una placa selectiva suplementada con antibióticos (kanamicina 25 g/ml) sobre el paño de terciopelo. Asegúrese de que el plato está tocando todo el terciopelo tocando cuidadosamente en el plato Petri como se describió anteriormente. Después, retire la placa. Deje las placas a temperatura ambiente para el crecimiento nocturno. Al día siguiente, evalúe tanto la placa de agar LB como la placa selectiva. Las colonias que crecen en los medios selectivos se cuentan como huéspedes de plásmido (es decir, resistentes a los antibióticos), mientras que las manchas libres de colonias son colonias que no tenían plásmidos y, por lo tanto, no son resistentes al antibiótico (es decir, pierden el plásmido). Esto se hace colocando las placas una sobre la otra y comparando el crecimiento (es decir, marcar las colonias que faltan) y contando el número de colonia en ambas placas. Esto produce el número de células que perdieron el plásmido durante el experimento de evolución. Repita este procedimiento a lo largo de todo el experimento de evolución de manera regular (por ejemplo, cada 14 transferencias). 3. Visualización de multimers de plásmido utilizando electroforesis de gel NOTA: La extracción de plásmidos de plásmidos de copia baja a menudo conduce a la contaminación con ADN cromosómico del huésped que necesita ser digerido enzimáticamente antes de la visualización. Extraiga ADN plásmido de un cultivo celular inmóvil de 5 ml utilizando lisis alcalina como se describe en el paso 1.5. Después, tratar el ADN plásmido extraído con una DNase dependiente de ATP que sólo corta el ADN cromosómico para eliminar la contaminación del ADN cromosómico (ver Tabla de Materiales). Incubar a 37 oC durante 30 minutos después, limpiar el ADN utilizando un kit de su elección. Para crear moléculas de círculo abierto de todas las conformaciones de plásmidos (monómeros o multimers), incubar las muestras de ADN plásmido con una enzima de mordida (Nb.BsrDI) e incubar durante 30 min a 65 oC. Paralelamente, para crear moléculas de plásmido lineal (es decir, para la comparación de tamaño plásmido), utilice una enzima de restricción de su elección (por ejemplo, HindIII) que corta el plásmido una vez.NOTA: Esto da como resultado monómeros de plásmido de ADN lineal. Las moléculas de círculo abierto no migran de manera lineal. Para visualizar el tamaño y la conformación del plásmido, electrophorese las muestras de ADN plásmido y lineal estallado durante 120 min a 4,3 V/cm en un gel de agarosa del 1% (p/v) y un tampón TAE de 1o. Las muestras se tiñen con Verde Midori y el gel se visualiza en un sistema de imágenes de gel (ver Tabla de Materiales). Utilice una escalera de 1 kbp.