実験的進化論におけるプラスミド媒介抗生物質耐性の定量化

1. 抗生物質耐性遺伝子を担持するモデルプラスミドの構築 注:株大腸菌K-12 MG1655は、すべての実験でモデル生物として使用されました(DSM No. 18039,微生物および細胞培養物のドイツコレクション、DSMZ)。株大腸菌DH5α17はプラスミド構築時に用いた。 PCRは、お好みのプラスミド骨格を増幅し、PCRによるプロモーター領域を含む耐性遺伝子を増幅する(図1)。 PCRは、プラスミドテンプレートpLC上の高忠実度ポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドpBBR1_for(5′-GCGGCCCTCTCT-3′)およびpBBR1_rev(5′-TACCGGCGCGTCUCUGT-3′)を用いてプラスミド骨格を増幅する(GenBank acc.MH238456)18. PCRは、高忠実度ポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドnptII_gib_forを用いた天然Tn5プロモーター19を含む耐性遺伝子nptIIを増幅する(5′-GCGCGGTAGCTCTCTCTTGTTTGTCTCTCTCACGCGCGCA-3′)およびnptII_gib_rev(5′-CGGGGGCCCCAAAAGGCGTGTGTGTCGTCGTCGTCGAGAnptII遺伝子はネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードし、カナマイシンに対する耐性を付与する。注:融合するプラスミド骨格に対して約20bpの相補配列を有する耐性遺伝子のプライマーを設計する。 お好みのキットを使用して、両方のPCRフラグメントをクリーニングします。 精製された抗生物質耐性遺伝子PCR産物(そのプロモーター領域を含む)を精製プラスミド骨格に結合し、等温アセンブリ20を使用して相同領域を融合し、50°Cで60分間。 融合した生成物を株大腸菌DH5αに電気電融合する。 ステップ1.3から40°Lの電気コンビテントセルに2μLの製品を4°Cおよび2.5 kVで導入します。リソジェニーブロス(LB)培地の1 mLで細胞を再サスペンドする。 全容積をマイクロファジチューブに移し、軌道シェーカーで250rpmで37°Cの揺れで1時間をインキュベートし、プラスミド上の抵抗マーカーの発現を可能にする。 適切な抗生物質(カナマイシン25μg/mL)を含むLB寒天プレート上の細胞のプレート100μLは、抗生物質耐性遺伝子を選択し、したがってプラスミド担持細胞を選択する。残りをスピンダウンし、上清を取り除き、セルを100μL LBで再サスペンドし、選択的寒天プレート上にプレートを取り付けます。プレートを37°Cで24時間インキュベートします。 クローンを検証するために、市販のミニプレップキットを使用してアルカリ性リシスを介して構築されたプラスミドを抽出します。 室温で12,000×gで遠心分離することにより静止した一晩培養の収穫5mL。 再懸濁液中の細胞を再懸濁し、次いで細胞溶液を溶解して中和する。12,000 x gで 5 分間遠心分離機 . キットに付属のDNA結合カラムに上清を移し、カラム膜を溶出緩衝液で溶出する前に、500μL洗浄液遠心分離液でカラムを2回洗浄します。 プラスミドのサンガーシーケンシングを実行し、配列が正しいことを確認します。 プラスミドの有効性が検証されると、上述したようにプラスミド(現在のpCON)を株大腸菌MG1655に電気ポパレートする。これは、株大腸菌MG1655 pCONを生じさせます。 2. 時間の経過につながった様々な条件下でプラスミドを運ぶ細菌をモニタリングする 注:進化実験は、2つの温度(37°Cと20°C)と3つの集団ボトルネックサイズで非選択的条件(LB媒体)下でプラスミド担持株を使用して行われます。実験計画は、様々な条件下でプラスミド持続性を研究するために使用されます。 時間の経過に従うプラスミド周波数に従う進化実験の設計 ( 図 2 ) 抗生物質(カナマイシン25μg/mL)を補充したLB寒天プレートに構築されたプラスミド運搬株(大腸菌MG1655 pCON)をプレートし、37°Cで一晩インキュベートします。 各井戸に1 mLのLB培地を備えた96の深井戸プレートを用意します。細菌の祖先として、独立した井戸の寒天プレートから8つのランダムに分離されたコロニーを選びます。プレートシェーカーの37°Cと450 rpmでプレートを24時間インキュベートし、祖先クローンの冷凍グリセロールストックを準備します。 翌日、実験計画に従って8つの反復母集団を新しい深井戸プレートに移す(図2)。カルチャは、希釈に PBS を使用して 1:100 (大きなボトルネック、L)、1:1,000 (中程度のボトルネック、M)、または 1:10,000 (小さなボトルネック、S) の合計ボリュームで希釈されます。希釈した培養物はいずれも37°Cおよび20°Cでインキュベートされる。注:96深井戸プレートのクロスコンタミネーションを制御することが非常に重要です。したがって、細菌のないLB培地と接種した井戸をインターカレートすることにより、チェッカーボードプレートの設計を使用してください。進化実験全体を通してこのパターンを使用します。 37°Cでインキュベートされた培養物は12時間ごとに移され、20°Cの培養物は24時間ごとに転写されます。注: 転送イベントごとにボトルネック サイズ処理が適用され、シリアル転送が合計 98 回の転送で繰り返されます。転送の数は、読者の実験計画によって異なります。 すべての人口の冷凍グリセロールストックを定期的に、週に2倍準備します。 レプリカめっきによるプラスミド周波数のモニタリング (図 3)注:進化実験では、集団中のプラスミド担持細胞の頻度は宿主の割合から推定される。レプリカめっきプロトコルを図 3に示します。 進化実験中に集団中のプラスミド頻度を決定するために、静止培養物を連続的に希釈し、非選択的LB寒天プレート上でめっきする。プレートあたり250-500コロニーの収率に応じて希釈を調整します。メモ:めっき前に厚いLB寒天プレート(約30mL寒天)を準備します。 めっきされた集団は、実験における成長温度に応じて一晩の成長のためにインキュベートされる。注:コロニーは小さく、したがって37°Cで<24時間をインキュベートする必要があります。 一晩の成長の後、手動または自動化されたコロニーカウントステーションを使用してすべてのコロニーをカウントし、培養中の総細菌集団サイズを計算します。注:寒天プレートの端にあるコロニーは、細菌細胞の総数に含めないでください。 オートクレーブで綿のベルベットの正方形の部分(〜20 x 20 cm)を殺菌します。注:ベルベットの布は、オートクレーブ可能にするために綿100%である必要があります。殺菌後に布を乾かすことが重要です。 ベルベットの布を殺菌した後、丸いブロックに布を置き、金属リングで固定します。しわを避けることは非常に重要です。成長したコロニー(寒天が下を向いている)でプレートを固定ベルベットの布の表面に慎重に置きます。すべてのコロニーが慎重に円形の方法でペトリ皿をタップしてベルベットの表面に触れることを確認してください。 LB寒天プレートを慎重に取り除き、抗生物質(カナマイシン25μg/mL)を補充した選択プレートをベルベットの布の上に置きます。前に説明したように、ペトリ皿を丁寧にタップして、プレートがすべてのベルベットに触れていることを確認してください。その後、プレートを取り外します。プレートは室温にしておくと、一晩の成長を得ます。 翌日、LB寒天板と選択板の両方を評価する。選択的媒体上で増殖するコロニーはプラスミド宿主(すなわち、抗生物質耐性)としてカウントされ、コロニーフリースポットはプラスミドフリーであり、したがって抗生物質に対して耐性を持たないコロニーである(すなわち、プラスミドを失った)。これは、プレートを互いに置き、成長を比較し(すなわち、欠落しているコロニーをマーク)、両方のプレートにコロニー番号をカウントすることによって行われます。これは、進化実験中にプラスミドを失った細胞の数を生じる。 進化実験全体に沿って、通常の方法(例えば、14回の転送ごと)に沿ってこの手順を繰り返します。 3. ゲル電気泳動を用いたプラスミド多量体の可視化 注:低コピープラスミドのプラスミド抽出は、多くの場合、可視化の前に酵素的に消化する必要がある宿主染色体DNAによる汚染につながります。 ステップ1.5に記載のアルカリ性リシスを用いて5mLの定常細胞培養物からプラスミドDNAを抽出する。 その後、抽出したプラスミドDNAをATP依存性DNaseで処理し、染色体DNAを切断するだけで染色体DNA汚染を除去します(材料表を参照)。37°Cで30分間インキュベートし、その後、お好みのキットを使用してDNAをきれいにします。 すべてのプラスミド立体構造(モノマーまたはマルチマー)の開いた円分子を作成するには、ニッキング酵素(Nb.BsrDI)を用いてプラスミドDNAサンプルをインキュベートし、65°Cで30分間インキュベートします。 並行して、直鎖状プラスミド分子(すなわち、プラスミドサイズ比較の場合)を作成するには、プラスミドを一度切断する任意の制限酵素(例えば、ヒンドIII)を使用する。注:これは、線形DNAプラスミドモノマーをもたらす。開いた円分子は直線的に移動しません。 プラスミドサイズと立体構造を可視化するために、エレクトロフェラーゼは、1%(w/v)アガロースゲルおよび1×TAE緩衝液中の4.3V/cmで120分間、ニックおよびリニアプラスミドDNAサンプルを120分間採取した。サンプルはみどり緑色で染色され、ゲルイメージングシステムでゲルを可視化します(材料表を参照)。1 kbp のラダーを使用します。