Количественная оценка плазмидно-опосредованного устойчивости к антибиотикам в экспериментальном подходе к эволюции

1. Конструкция модели плазмиды, несущей ген устойчивости к антибиотикам ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм Escherichia coli K-12 MG1655 использовался в качестве образцового организма во всех экспериментах (DSM No 18039, Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур, DSM). Штамм E. coli DH5’17 использовался во время плазмидной конструкции. ПЦР усиливают плазменную основу по вашему выбору и усиливают ген сопротивления, включая область промотора по ПЦР(рисунок 1). ПЦР усиливают плазменную хребет с помощью полимеразы высокой точности и олигонуклеотидов pBBR1_for (5′-GCGGCCGGGGCTCT-3′) и pBBR1_rev (5′-TACGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGT-3′) на плазменных шаблонах pLC (GenBank acc. no. MH238456)18. PCR усиливают ген сопротивления nptII включая родной промоутер Tn5 19 с использованием полимеразы высокой точности и олигонуклеотидов nptII_gib_for (5′-GCGGGTAGCTCTCTCTCTCTTTTGACGTCACGCCGCA-3′) и nptII_gib_rev (5′-CGGTGGCCCAAAAGGCC Ген nptII кодирует фосфотрансферазу неомицина и придает устойчивость канамицину.ПРИМЕЧАНИЕ: Дизайн праймеров для гена сопротивления с примерно 20 bp дополнительной последовательности плазмидной позвоночника, что он будет слиты. Очистите оба фрагмента ПЦР, используя комплект по вашему выбору. Присоединяйтесь к очищенной устойчивости к антибиотикам генп ПЦР продукт (в том числе его промотор региона) для очищенной плазмидной позвоночника и сплавить гомологичные области с использованием изотермальной сборки20, при 50 кв кс в течение 60 мин. Электропорировать сросшиеся продукты в штамм E. coli DH5. Ввести 2 зл и l продукта со ступени 1,3 до 40 л электрокомпетентных клеток в 2 мм кюветы при 4 кВ и 2,5 кВ. Переплетить клетки в 1 мл лисогенного бульона (LB) среды. Перенесите общий объем в микрофугую трубку и инкубировать 1 ч при 37 градусах Постряски при 250 об/мин в орбитальном шейкере, чтобы обеспечить выражение маркера сопротивления на плазмиде. Плита 100 л клеток на пластинах агара LB, содержащих соответствующий антибиотик (канамицин 25 мкг/мл), чтобы выбрать ген устойчивости к антибиотикам и таким образом выбрать для плазмид-несущих клеток. Спин вниз остальные, удалить супернатант, resuspend клетки в 100 ЛЛ л. и пластины на селективной пластины агара. Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию в течение 24 ч. Для проверки клонов извлеките сконструированные плазмиды с помощью щелочным лисисом с помощью коммерческого мини-подготовительного комплекта. Урожай 5 мл стационарной ночной культуры центрифугипригана при температуре в комнате 12 000 х г. Resuspend клетки в растворе, затем лизировать и нейтрализовать клеточный раствор. Центрифуга в течение 5 мин при 12 000 х г. Перенесите супернатант в связывающую колонку ДНК, представленную в комплекте, и дважды промойте колонку с помощью 500-й л стирального раствора центрифугирование мембраны 2x, прежде чем вывести мембрану колонны с буфером элютации. Выполните секвенирование плазмиды Sanger, чтобы подтвердить, что последовательность верна. После того, как плазмид действительность проверяется, электропорат плазмиды (теперь pCON) в штамм E. coli MG1655, как описано выше. Это дает штамм E. coli MG1655 pCON. 2. Мониторинг плазмид-несущих бактерий в различных условиях с течением времени ПРИМЕЧАНИЕ: Эволюция эксперимент проводится с плазмидно-несущих штаммов в неселективных условиях (LB media) в двух температурах (37 градусов по Цельсию и 20 градусов по Цельсию) и три популяции узких размеров. Экспериментальная конструкция используется для изучения плазмидной стойкости в различных условиях. Дизайн эволюционный эксперимент следовать плазмидной частоты с течением времени (Рисунок 2) Плита построен плазмид-несущий штамм(E. coli MG1655 pCON) на LB агар пластины дополнены антибиотиками (канамицин 25 мкг/мл) и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию. Приготовьте 96 глубоководных пластин с 1 мл среды LB в каждой скважине. Как бактериальные предки, выбрать восемь случайных изолированных колоний из агар пластины в независимых скважин. Инкубировать пластины при 37 градусах Цельсия и 450 об/мин на тарелке шейкера для 24 ч. Приготовьте замороженный глицерол бульон клонов предков. На следующий день передать восемь реплицировать популяции в новые глубоководные пластины в соответствии с экспериментальной конструкции(рисунок 2). Культуры разбавлены 1:100 (большое узкое место, L), 1:1,000 (среднее узкое место, M), или 1:10,000 (небольшое узкое место, S) в общем объеме 1 мл LB с использованием PBS для разбавления. Разбавленные культуры инкубируются при 37 градусах Цельсия и 20 градусах Цельсия.ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно контролировать перекрестное загрязнение в пластине 96-глубокой скважины. Таким образом, используйте конструкцию пластины, пересекая привитые скважины с безбактериевной средой LB. Используйте эту модель в рамках всего эксперимента эволюции. Культуры, инкубированные при 37 градусах Цельсия, передаются каждые 12 ч, в то время как культуры при 20 градусах Цельсия передаются каждые 24 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Во время каждого события передачи применяется обработка размера узких мест и серийная передача повторяется в общей сложности 98 переводов. Количество переводов будет зависеть от экспериментального дизайна читателей. Подготовьте замороженный глицерол запас всех популяций регулярно, 2 x в неделю. Мониторинг плазмидной частоты путем реплики покрытия (Рисунок 3)ПРИМЕЧАНИЕ: В ходе эксперимента по эволюции частота плазмидно-переносных клеток в популяции оценивается по доле хозяев. Протокол покрытия реплики отображается на рисунке 3. Для определения плазмидной частоты в популяции в ходе эксперимента по эволюции стационарные культуры последовательно разбавляются и покрываются неселективными агарными пластинами LB. Отрегулируйте разбавление в соответствии с урожайностью 250-500 колоний на тарелку.ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте толстые пластины lb агара до покрытия (агар 30 мл). Покрытые популяции инкубируются для ночного роста в зависимости от температуры роста в эксперименте.ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии должны быть небольшими, таким образом, инкубировать йlt;24 ч при 37 градусов по Цельсию. После ночного роста, подсчитайте все колонии с помощью ручной или автоматизированной станции подсчета колоний и вычислите общий размер бактериальной популяции в культурах.ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии на краю агаровой пластины не должны быть включены в общее количество бактериальных клеток. Стерилизовать квадратные куски (20 х 20 см) из хлопчатобумажного бархата путем автоклавирования.ПРИМЕЧАНИЕ: бархатная ткань должна быть 100% хлопка, чтобы быть autoclavable. Важно высушить ткань после стерилизации. После стерилизации бархатной ткани поместите ткань на круглый блок и зафиксируйте ее металлическим кольцом. Очень важно, чтобы избежать морщин. Аккуратно поместите тарелку с выращенными колониями (агаром вниз) на фиксированной бархатной ткани поверхности. Убедитесь, что все колонии коснуться бархатной поверхности, тщательно нажав на чашку Петри в круговой манере. Аккуратно снимите пластину LB агара и поместите селективную пластину, дополненную антибиотиками (канамицин 25 мкг/мл) на бархатную ткань. Убедитесь, что пластина касается всех бархат, тщательно нажав на чашку Петри, как описано ранее. После этого снимите тарелку. Оставьте пластины при комнатной температуре для ночного роста. На следующий день оцените как пластину lb агара, так и селективную пластину. Колонии, которые растут на селективных носителях, считаются плазмидными хозяевами (т.е. устойчивыми к антибиотикам), в то время как свободные от колоний места являются колониями, которые были без плазмида и, таким образом, не устойчивы к антибиотикам (т.е. утрачены плазмидными). Это делается путем размещения пластин друг над другом и сравнения роста (т.е. пометить любые отсутствующие колонии) и подсчета числа колоний на обеих пластинах. Это дает количество клеток, которые потеряли плазмида во время эксперимента эволюции. Повторите эту процедуру вдоль всего эксперимента эволюции в регулярном порядке (например, каждые 14 переводов). 3. Визуализация плазмидных мультимер с использованием геля электрофореза ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида экстракции плазмиды с низким уровнем копирования часто приводит к загрязнению хост хромосомной ДНК, которая должна быть ферментативно усваивается до визуализации. Извлеките плазмидную ДНК из 5 мл стационарной ночной клеточной культуры с помощью щелочного лисиса, как описано в шаге 1.5. После этого, лечить извлеченные плазмидной ДНК с АТФ-зависимых DNase, что только сокращение хромосомной ДНК для удаления хромосомных загрязнения ДНК (см. Таблица материалов). Инкубировать при 37 градусах По Цельсию в течение 30 мин. После этого очистите ДНК с помощью комплекта по вашему выбору. Для создания молекул открытого круга всех плазмидных конформий (мономеров или мультимеров) инкубировать образцы плазмидной ДНК с ферментом nicking (Nb.BsrDI) и инкубировать в течение 30 мин при 65 градусах Цельсия. Параллельно, для создания линейных молекул плазмида (т.е. для сравнения размеров плазмида), используйте фермент ограничения по вашему выбору (например, HindIII), который расщепляет плазмид один раз.ПРИМЕЧАНИЕ: Это приводит к линейной ДНК плазмидных мономеров. Молекулы открытого круга не мигрируют линейным образом. Чтобы визуализировать размер плазмида и конформацию, электрофорезы nicked и линейных образцов плазмид ДНК в течение 120 минут при 4,3 V/cm в 1% (w/v) агарозный гель и буфер TAE 1″. Образцы окрашены с Midori зеленый и гель визуализирован на гель визуализации системы (см. Таблица материалов). Используйте лестницу 1 кбит/с.