קוונפיקציה של פלמיד בתיווך עמידות לאנטיביוטיקה בגישת אבולוציה ניסויית

1. בניית פלאמיד דגם הנושא גן עמידות לאנטיביוטיקה הערה: הנבג מהווה את האורגניזם הMG1655 של ה-K-12 שימש כיצור מודל בכל הניסויים (DSM No. 18039, אוסף גרמני של מיקרואורגניזמים ותרביות תאים, DSMZ). המתח E. coli DH5α17 שימש במהלך בנייה פלביניים. ה-PCR מגבירים את עמוד השדרה הפלמאני על פי בחירתך ומגבירים את גן ההתנגדות כולל אזור המקדם של ה-PCR (איור 1). PCR הגבר את עמוד השדרה הפלטמאני באמצעות פולימראז איכותי והאוגמונואודים pBBR1_for (5 ‘-GCGGCCACCTGGCT-3 ‘) וpBBR1_rev (5 ‘-TACCGGCGCGGCAGCGTGACCC-3 ‘) על התבנית היחידה לpLC (GenBank acc. לא. MH238456)18. PCR הגבר את גן ההתנגדות Nptii כולל את Tn5 יזם המקורי19 באמצעות פולימראז באיכות גבוהה ו-olig, מNPTII_GIB_FOR (5 ‘-GCGCCGGTAGATCTGCTCATGTTTGAAGCTTCACGCTGCCGCA-3 ‘) ו-nptII_gib_rev (5 ‘-CGGTGGCCGCCAAAAAGGCCATCCGTCAGGTCAGAAGAACTCGT-3 ‘). הגן Nptii מקודד neomycin פוספוליאז ומעביר התנגדות לקאנאמיצין.הערה: לעצב את התחל של גן ההתנגדות עם כ 20 bp של רצף משלים לעמוד השדרה הפלמאני שהוא יהיה מחובר. נקה את שני שברי ה-PCR באמצעות ערכה לפי בחירתך. הצטרפות מוצר התנגדות לאנטיביוטיקה מטוהרים המוצר (כולל אזור המקדם שלה) לעמוד השדרה הטהור פלמיד ונתיך האזורים הומולוגיים באמצעות איזותרמי הרכבה20, ב 50 ° c עבור 60 min. אלקטרופורף את המוצר התמזגו לתוך המתח E. coli DH5α. הצג 2 μL של המוצר משלב 1.3 לתוך 40 μL של תאים אלקטרומוסמכים ב-2 מ”מ כימיקלים ב 4 ° c ו 2.5 kV. השהה את התאים מחדש ב-1 מ ל של מדיום (LB). העבר את אמצעי האחסון הכולל לצינור microfuge ו-דגירה 1 h ב 37 ° צ’ לרעוד ב 250 rpm ב שייקר מסלולית כדי לאפשר את הביטוי של סמן ההתנגדות על הפלביניים. צלחת 100 μL של התאים בלוחות LB אגר המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה (kanamycin ‘ 25 μg/mL) כדי לבחור את הגן עמידות לאנטיביוטיקה ובכך לבחור עבור התאים הנושאת פלבאמצע. ספין למטה את השאר, להסיר את supernatant, להשעות מחדש את התאים ב100 μL ליברות ולוחית על צלחת אגר בררני. מודאת לוחיות הרישוי ב-37 ° c עבור 24 שעות. כדי לאמת שיבוטים, לחלץ את הפלמידים שנבנו באמצעות הליזה אלקליין באמצעות ערכת מיני מסחרי הכנה. קציר 5 מ ל של תרבות לילה נייח על ידי תפרידו ב 12,000 x g בטמפרטורת החדר. השהה מחדש את התאים בפתרון מחדש, לאחר מכן lyse ונטרל את פתרון התא. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 12,000 x g. העבר את supernatant אל העמודה איגוד ה-DNA המסופק בערכה ולשטוף את העמודה פעמיים עם 500 μL תפרידו פתרון כביסה 2x לפני משחרר את קרום הטור עם מאגר משחררי. בצעו רצף של הפלסמאמצע כדי לוודא שהרצף נכון. ברגע שתוקף הפלסמה מאומת, אלקטרופורף את הפלמיד (עכשיו pCON) לתוך המתח E. coli MG1655 כפי שמתואר לעיל. זה התשואות מאמץ E. coli MG1655 pcon. 2. ניטור הפלשבאמצע הנושא חיידקים בתנאים שונים לאורך זמן הערה: הניסוי באבולוציה מתנהל עם זנים בעלי בעיות בתנאים לא סלקטיבית (LB media) בשני טמפרטורות (37 ° c ו-20 ° c) ושלושה גדלים של בקבוק צוואר. העיצוב הניסיוני משמש ללימוד התמדה בפלסמיד בתנאים שונים. תכנון של ניסוי האבולוציה כדי לעקוב אחר תדירות הפלביניים לאורך זמן (איור 2) צלחת בנוי פלפריאמצע הנושא את המתח (E. coli MG1655 pcon) על LB אגר צלחות שיושלם עם אנטיביוטיקה (kanamycin ‘ 25 μg/mL) ו-דגירה לילה ב 37 ° c. להכין 96 לוחות עמוקים עם 1 מ ל של LB בינונית בכל טוב. כמו האבות החיידקיים, לבחור שמונה מושבות מבודדים אקראית מלוחית אגר בבארות עצמאיות. מודקת את הצלחות ב 37 ° צ’ ו 450 rpm על צלחת שייקר עבור 24 h. הכינו מלאי של גליצרול קפוא של שיבוטים אב קדמון. היום למחרת העבירו את שמונת האוכלוסיות ללוחות היטב החדשים בהתאם לתכנון הניסיוני (איור 2). התרבויות הם מדולל 1:100 (צוואר גדול, L), 1:1000 (צוואר בינוני, M), או 1:10000 (צוואר בקבוק קטן, S) בנפח כולל של 1 mL LB באמצעות PBS עבור דילול. התרבויות מדולל מודולות ב 37 ° c ו 20 ° c.הערה: חשוב מאוד לשלוט בזיהום הצולב בצלחת 96-הבאר העמוקה. כך, השתמש בלוח לוח שחמט על-ידי בארות מחוסן מפני העור עם חיידקים מדיום ליברות חינם. השתמש בדפוס הזה. דרך כל ניסוי האבולוציה התרבויות ב-37 ° c מועברות מדי 12 שעות בעוד שתרבויות ב -20 ° c מועברות כל 24 שעות.הערה: במהלך כל אירוע העברה מוחל הטיפול בגודל צוואר הבקבוק וההעברה הטורית חוזרת על סך של 98 העברות. מספר ההעברות יהיה תלוי בעיצוב הניסיוני של הקוראים. להכין מלאי של גליצרול קפוא של כל האוכלוסיות באופן קבוע, 2x בשבוע. ניטור תדר פלביניים על ידי ציפוי עותק משוכפל (איור 3)הערה: במהלך ניסוי האבולוציה, תדירות הצפיפות של התאים באוכלוסייה באוכלוסיה מוערכת מיחס המארחים. פרוטוקול ציפוי העותקים המשוכפלים מוצג באיור 3. כדי לקבוע את תדר הפלביניים באוכלוסייה במהלך ניסוי האבולוציה, תרבויות נייחים מדולל באופן סדרתי ומצופה על צלחות LB אגר ליברות. התאימו את הדילול בהתאם לתשואה של 250-500 מושבות לכל צלחת.הערה: להכין צלחות ליברות אגר עבה לפני ציפוי (~ 30 מ ל אגר). האוכלוסיות הציפוי מודשות לצמיחת לילה בהתאם לטמפרטורת הצמיחה שלהם בניסוי.הערה: המושבות צריכות להיות קטנות, ובכך להדגירה < 24 שעות ב 37 ° c. לאחר הצמיחה לילה, לספור את כל המושבות באמצעות מספר ידני או אוטומטי המושבה התחנה ולחשב את גודל האוכלוסיה החיידקית הכולל בתרבויות.הערה: המושבות בקצה של הצלחת אגר לא צריך להיכלל בספירת התאים החיידקיים הכולל. לעקר חתיכות מרובעות (~ 20 x 20 ס מ) של קטיפה כותנה על ידי אוטוקלינג.הערה: בד הקטיפה צריך להיות 100% כותנה כדי להיות אוטומטית. חשוב לייבש את הבד לאחר עיקור. לאחר עיקור של הבד הקטיפתי, הניחו את הבד על בלוק עגול ותקנו אותו בטבעת מתכת. חשוב להימנע מקמטים. מניחים בזהירות את הצלחת עם המושבות מבוגרים (אגר פונה למטה) על משטח בד קטיפה קבוע. ודא שכל המושבות נוגעות במשטח הקטיפה על-ידי הקשה בזהירות על צלחת פטרי באופן מעגלי. הסר בזהירות את הצלחת ליברות אגר ומקום צלחת סלקטיבית שיושלם עם אנטיביוטיקה (kanamycin ‘ 25 μg/mL) על הבד קטיפה. ודא כי הצלחת נוגעת בכל הקטיפה על ידי הקשה בקפידה על צלחת פטרי כפי שמתואר לפני. . לאחר מכן, הסר את הצלחת השאירו את הצלחות בטמפרטורת החדר לצמיחת הלילה. למחרת, הערכה הן את לוחית ליברות אגר ואת הצלחת סלקטיבי. המושבות לצמוח על התקשורת סלקטיבי נספרים כמו פלמיד המארחים (כלומר, עמידות לאנטיביוטיקה), בעוד כתמים ללא מושבה הם מושבות כי היו בחינם ולכן הם לא עמידים לאנטיביוטיקה (כלומר, איבד את הפלמיד). הדבר נעשה על-ידי הצבת הלוחות זה על זה והשוואת הצמיחה (כלומר, לסמן מושבות חסרות) ולספור את מספר המושבה על שתי הצלחות. זה מניב את מספר התאים שאיבדו את הפלסמיד במהלך ניסוי האבולוציה. חזור על הליך זה לאורך כל ניסוי האבולוציה באופן קבוע (לדוגמה, כל 14 העברות). 3. ויזואליזציה של פלסמיד באמצעות אלקטרופורזה ג’ל הערה: הוצאת פלמידים מפלסטיק נמוך מובילה לעתים קרובות לזיהום באמצעות דנ א כרומוזום מארח שצריך להיות מתעכל לפני ההדמיה. לחלץ את ה-DNA מתוך 5 mL הנייח לילה התרבות התא באמצעות הליזה אלקליין כמתואר בשלב 1.5. לאחר מכן, לטפל ב-DNA המחולצים עם DNase ATP תלוי כי רק חותך דנ א כרומוזומלית להסיר זיהום DNA כרומוזומלית (ראה טבלת חומרים). מודקון ב 37 ° c עבור 30 דקות. לאחר מכן, נקה את ה-DNA באמצעות ערכת לפי בחירתך. כדי ליצור מולקולות מעגל פתוח של כל הקונמציות פלביניים (monomers או מומים), דגירה דגימות ה-DNA הפלמיד עם אנזים חותך (Nb. BsrDI) ו דגירה עבור 30 דקות ב 65 ° c. במקביל, כדי ליצור המולקולות פלביניים ליניארי (כלומר, עבור השוואת גודל פלמיד), להשתמש באנזים הגבלה של הבחירה שלך (למשל, hindiii) כי דבק את הפלמיד פעם.הערה: התוצאה היא מונמרים DNA ליניארי. מולקולות מעגל פתוח אינן מנודדות באופן ליניארי. כדי להמחיש את גודל הפלסטלינה והיווצרות, אלקטרופורזה את בדיקות DNA ליניארי וליניארית עבור 120 דקות ב 4.3 V/cm ב 1% (w/V) agarose ג’ל ו 1 × טאה מאגר. הדגימות מוכתמות בעזרת מידורי גרין והג’ל מדמיין במערכת הדמיה של ג’ל (ראה טבלת חומרים). . השתמש בסולם של 1-bp