Deneysel Evrim Yaklaşımında Plazmid Aracılı Antibiyotik Direncinin Ölçülmesi

1. Antibiyotik direnç geni taşıyan bir model plazmidin yapımı NOT: Escherichia coli K-12 MG1655 türü tüm deneylerde model organizma olarak kullanılmıştır (DSM No. 18039, Alman Mikroorganizmalar ve Hücre Kültürleri Koleksiyonu, DSMZ). E. coli DH5α17 suşplazmid yapımı sırasında kullanılmıştır. PCR seçtiğiniz plazmid omurgasını yükseltmek ve PCR tarafından organizatör bölge de dahil olmak üzere direnç geni yükseltmek(Şekil 1). PCR plazmid kalıbı pLC (GenBank acc. no) üzerinde plazmid omurgasını yüksek sadakatli polimeraz ve oligonükleotidpBBR1_for (5′-GCGGCCACCGGCTGGCTCT-3′) ve pBBR1_rev (5′-TACCGGCGCCAGCGTGACCC-3′) kullanarak güçlendirin. MH238456)18. PCR direnç gen nptII yerli Tn5 promotör19 yüksek sadakat polimeraz ve oligonükleotidler nptII_gib_for kullanarak dahil direnç gen nptII yükseltmek (5′-GCGCCCCGGATCTCTCTCTCTGTTGAAGCTGGGGGGCA-3′) ve nptII_gib_rev (5′-CGGTGGCCCCCCCCAAAAAAAAAACCCCCCCCCAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGAGAAGAACTGT-3′ kullanarak. NptII geni neomisin fosfotransferaz için kodlar ve kanamisin direnci ni verir.NOT: Direnç geni için astarları, erimiş olacağı plazmid omurgasına yaklaşık 20 bp tamamlayıcı sıra ile tasarlayın. Seçtiğiniz bir kiti kullanarak her iki PCR parçasını da temizleyin. Saflaştırılmış antibiyotik direnci geni PCR ürününe (organizatörü bölge dahil) saflaştırılmış plazmid omurgasına katılın ve 50 °C’de 60 dakika boyunca isothermal montaj20kullanarak homolog bölgeleri birleştirin. Erimiş ürünü E. coli DH5α gerilimine elektroporate edin. 4 °C ve 2,5 kV’da 2 mm’lik kürlerde 1,3’ten 40°L’lik elektrobeceriksiz hücrelere kadar ürünün 2 μL’sini tanıtın. Hücreleri 1 mL’lik lysogeny suyu (LB) ortasında yeniden askıya alın. Plazmid üzerindeki direnç belirtecinin ekspresyonuna izin vermek için toplam hacmi bir mikrofuge tüpüne aktarın ve 37 °C’de 250 rpm’de orbital çalkalayıcıyla 1 saat kuluçkaya yatırın. Uygun antibiyotik içeren LB agar plakaları (kanamisin 25 μg/mL) içeren hücrelerin Plaka 100 μL antibiyotik direnci geni için seçin ve böylece plazmid taşıyan hücreler için seçin. Geri kalanını aşağı çevirin, süpernatant’ı çıkarın, 100°L LB’deki hücreleri ve seçici bir agar plakaüzerindeki plakayı yeniden askıya alın. Plakaları 37 °C’de 24 saat kuluçkaya yatırın. Klonları doğrulamak için, ticari bir mini hazırlık kiti kullanarak alkali lysis ile inşa plazmidler ayıklayın. Oda sıcaklığında 12.000 x g’de santrifüj ederek sabit bir gecede 5 mL hasat. Resuspension çözeltisi hücreleri resuspend, sonra lyse ve hücre çözeltisi nötralize. 12.000 x g5 dakika santrifüj . Süpernatant’ı kitte sağlanan DNA bağlama sütununa aktarın ve kolon membranını elüsasyon tamponuyla eluting yapmadan önce 500 μL yıkama çözeltisi santrifüjü yle iki kez yıkayın. Dizinin doğru olduğunu doğrulamak için plazmidin Sanger sıralamasını gerçekleştirin. Plazmid geçerliliği doğrulandıktan sonra, yukarıda açıklandığı gibi plazmidi (şimdi pCON) e. coli MG1655 gerilimine elektroporate. Bu gerilme E. coli MG1655 pCON verimleri. 2. Plazmid taşıyan bakterilerin zaman içinde çeşitli koşullar altında izlenmesi NOT: Evrim deneyi, selektif olmayan koşullarda (LB media) iki sıcaklıkta (37 °C ve 20 °C) ve üç popülasyon darboğaz boyutunda plazmid taşıyan suşlarla gerçekleştirilmiştir. Deneysel tasarım çeşitli koşullar altında plazmid kalıcılığı incelemek için kullanılır. Zaman içinde plazmid frekansını takip etmek için bir evrim deneyinin tasarımı (Şekil 2) Lb agar plakalarında antibiyotiklerle takviye edilmiş (kanamisin 25 μg/mL) ve bir gecede 37 °C’de kuluçkaya yatırılan plazmid taşıyan suşu(E. coli MG1655 pCON) plakalayın. Her kuyuda 1 mL LB orta ile 96 derin kuyu plakası hazırlayın. Bakteri ataları olarak, bağımsız kuyularda agar plaka sekiz rasgele izole koloniler seçin. Plakaları 37 °C ve 450 rpm’de 24 saat boyunca bir tabak çalkalayıcıüzerinde kuluçkaya yatırın. Ertesi gün sekiz çoğaltma popülasyonları deneysel tasarıma göre yeni derin kuyu plakalarına aktarır(Şekil 2). Kültürler seyreltme için PBS kullanılarak 1 mL LB toplam hacmi 1:100 (büyük darboğaz, L), 1:1.000 (orta darboğaz, M) veya 1:10.000 (küçük darboğaz, S) seyreltilmiş. Seyreltilmiş kültürlerin her ikisi de 37 °C ve 20 °C’de kuluçkaya yatırılır.NOT: 96-derin kuyu plakasında çapraz kontaminasyonun kontrol edilmesi son derece önemlidir. Böylece, bakteri içermeyen LB orta ile aşılanmış kuyular intercalating tarafından bir dama plaka tasarımı kullanın. Tüm evrim deneyi boyunca bu deseni kullanın. 37 °C’de kuluçkaya yatan kültürler her 12 saatte bir, 20 °C’deki kültürler ise her 24 saatte bir aktarılır.NOT: Her aktarım olayı sırasında darboğaz boyutu tedavisi uygulanır ve seri aktarım toplam 98 aktarım üzerinden tekrarlanır. Transfer sayısı okuyucuların deneysel tasarımına bağlıdır. Düzenli olarak tüm popülasyonların dondurulmuş gliserol stok hazırlayın, 2x bir hafta. Plazmid frekansını çoğaltma kaplaması ile izleme (Şekil 3)NOT: Evrim deneyi sırasında, popülasyonda plazmid taşıyan hücrelerin sıklığı konakların oranından tahmin edilmektedir. Çoğaltma kaplama protokolü Şekil 3’tegösterilmiştir. Evrim deneyi sırasında popülasyondaki plazmid sıklığını belirlemek için, sabit kültürler seri olarak seyreltilir ve seçici olmayan LB agar plakaları üzerine kaplanır. Plaka başına 250-500 kolonilerin bir verim göre seyreltme ayarlayın.NOT: Kaplamadan önce kalın LB agar plakaları hazırlayın (~30 mL agar). Kaplama popülasyonları, deneydeki büyüme sıcaklıklarına göre bir gecede büyüme için kuluçkaya yatırılır.NOT: Kolonilerin küçük olması gerekir, bu nedenle 37 °C’de kuluçka <24 saat. Bir gecede büyümeden sonra, manuel veya otomatik koloni sayma istasyonu kullanarak tüm kolonileri sayın ve kültürlerdeki toplam bakteri popülasyon uyrcadını hesaplayın.NOT: Agar plakasının kenarındaki koloniler toplam bakteri hücre sayısına dahil edilmemelidir. Otoklavlama kare parçaları (~ 20 x 20 cm) pamuk kadife sterilize.NOT: Kadife kumaşın otoklavlanabilmesi için 0 pamuk olması gerekir. Sterilizasyondan sonra bezin kurutulması önemlidir. Kadife bez sterilizasyon sonra, yuvarlak bir blok üzerine bez yerleştirin ve metal bir halka ile düzeltmek. Kırışıklıkları önlemek için çok önemlidir. Dikkatle sabit kadife bez yüzeyinde büyümüş koloniler (agar aşağı bakan) ile plaka yerleştirin. Tüm kolonilerin Petri kabına dairesel bir şekilde dikkatlice dokunarak kadife yüzeye dokunduğundan emin olun. LB agar plakasını dikkatlice çıkarın ve kadife bezin üzerine antibiyotiklerle (kanamisin 25 μg/mL) takviye edilmiş seçici bir plaka yerleştirin. Plakanın daha önce açıklandığı gibi Petri kabına dikkatlice dokunarak tüm kadifeye dokunduğundan emin olun. Daha sonra, plakayı çıkarın. Gece büyüme için oda sıcaklığında plakaları bırakın. Ertesi gün, hem LB agar plaka ve seçici plaka değerlendirmek. Seçici ortamda yetişen koloniler plazmid konakları olarak sayılır (örn. antibiyotiğe dirençli), koloniiçermeyen noktalar plazmidiçermeyen kolonilerdir ve bu nedenle antibiyotiğe dirençli değildir (yani plazmidi kaybetmiştir). Bu, plakaları birbirinin üzerine koyarak ve büyümeyi karşılaştırarak (yani, eksik kolonileri işaretleyerek) ve her iki plakadaki koloni numarasını sayarak yapılır. Bu evrim deneyi sırasında plazmid kaybetti hücrelerin sayısını verir. Bu yordamı tüm evrim deneyi boyunca düzenli bir şekilde tekrarlayın (örn. her 14 transfer). 3. Jel elektroforezkullanılarak plazmid multimerlerinin görüntülenmesi NOT: Düşük kopya plazmidlerin plazmid ekstraksiyonu genellikle görüntülemeden önce enzimatik olarak sindirilmesi gereken konak kromozomal DNA ile kontaminasyona yol açar. Adım 1.5’te açıklandığı gibi alkali lysis kullanarak 5 mL sabit bir gece hücre kültüründen plazmid DNA ayıklayın. Daha sonra, çıkarılan plazmid DNA’sını sadece kromozom alınını ortadan kaldırmak için kromozom almını kesen ATP’ye bağımlı bir DNase ile tedavi edin(bkz. 37 °C’de 30 dk. Daha sonra seçtiğiniz bir kit kullanarak DNA’yı temizleyin. Tüm plazmid konformasyonlarının (monomerler veya multimerler) açık daire molekülleri oluşturmak için, plazmid DNA örneklerini bir çentik enzimi (Nb.BsrDI) ile kuluçkaya yatırın ve 65 °C’de 30 dakika kuluçkaya yatırın. Buna paralel olarak, lineer plazmid molekülleri oluşturmak için (yani, plazmid boyutu karşılaştırması için), plazmidi bir kez cleaves seçtiğiniz bir kısıtlama enzimi kullanın (örneğin, HindIII).NOT: Bu lineer DNA plazmid monomerler ile sonuçlanır. Açık daire molekülleri doğrusal bir şekilde göç etmezler. Plazmid boyutunu ve konformasyonu görselleştirmek için, 120 dk için 120 dk 4,3 V/cm’de %1 (w/v) agarose jel ve 1× TAE tamponu için çentikli ve lineer plazmid DNA örneklerini elektrofore edin. Örnekler Midori yeşili ile boyanmış ve jel bir jel görüntüleme sistemi üzerinde görselleştirilmiştir (Malzeme Tablosubakınız). 1 kbp merdiven kullanın.