Quantificação da resistência aos antibióticos mediada por plasmídeos em uma abordagem de evolução experimental

1. Construção de um plasmídeo modelo carregando um gene de resistência aos antibióticos NOTA: A cepa Escherichia coli K-12 MG1655 foi usada como organismo modelo em todos os experimentos (DSM Nº 18039, Coleção Alemã de Microorganismos e Culturas Celulares, DSMZ). A cepa E. coli DH5α17 foi usada durante a construção plasmídeo. PCR amplifica rolha amplificar a espinha dorsal plasmídeo de sua escolha e amplificar o gene de resistência, incluindo a região promotor por PCR (Figura 1). PCR amplificar a espinha dorsal plasmídeo usando uma polimerização de alta fidelidade e os oligonucleotídeos pBBR1_for (5′-GCGGACCGGGGGGGGCT-3′) e pBBR1_rev (5′-TACGCGCGCGCGCGCGCGGCGACCC-3′) no modelo plasmídeo pLC (GenBank acc no. MH238456)18. PCR amplificar o gene de resistência nptII incluindo o nativo Tn5 promotor19 usando uma polimererase de alta fidelidade e oligonucleotídeos nptII_gib_for (5′-GCGCCGGGGATGCATGCTCATTGATGAAGCTTGCTGCCGCGCA-3′) e nptII_gib_rev (5′-CGGTGGGCGCGCCAAAAGGCCCCCCCCCACCCACAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACGCGT-3′). O gene nptII codifica uma fosfortransferase de neomicina e confere resistência à kanamicina.NOTA: Projete as cartilhas para o gene da resistência com aproximadamente 20 bp da seqüência complementar à espinha dorsal plasmídea a que será fundida a. Limpe ambos os fragmentos pcr usando um kit de sua escolha. Junte-se ao produto pcr de gene resistência aos antibióticos purificado (incluindo sua região promotora) à espinha dorsal plasmítica purificada e funda as regiões homólogas usando montagem isomal20,a 50 °C por 60 min. Eletroporato o produto fundido na cepa E. coli DH5α. Introduzir 2 μL do produto da etapa 1.3 em 40 μL de pilhas electrocompetent em cuvettes de 2 milímetros em 4 °C e 2.5 kV. Resuspender as células em 1 mL de caldo de lysogeny (LB) médio. Transfira o volume total para um tubo de microfúria e incubar 1 h a 37 °C tremendo a 250 rpm em um agitador orbital para permitir a expressão do marcador de resistência no plasmídeo. Placa 100 μL das células em placas de ágar LB contendo o antibiótico apropriado (kanamicina 25 μg/mL) para selecionar para o gene de resistência aos antibióticos e, assim, selecionar para células portadoras de plasmídeos. Desça o resto, retire o supernatant, resuspenda as células em 100 μL LB e placa em uma placa de ágar seletiva. Incubar as placas a 37 °C por 24 h. A fim verificar clones, extraa os plasmids construídos através da lyse alcalina usando um jogo mini-prep comercial. Colheita 5 mL da cultura estacionária durante a noite por centrífuga em 12.000 x g à temperatura ambiente. Resuspenda as células em solução de resuspensão, em seguida, lyse e neutralizar a solução celular. Centrífuga por 5 min a 12.000 x g. Transfira o supernatant à coluna de ligação do ADN fornecida no jogo e lave a coluna duas vezes com a solução de lavagem de 500 μL que centrifuging 2x antes de eluting a membrana da coluna com tampão da elução. Realize o sequenciamento de Sanger do plasmídeo para confirmar que a sequência está correta. Uma vez verificada a validade plasmítica, eletroporato o plasmídeo (agora pCON) na cepa E. coli MG1655 como descrito acima. Isso produz cepa E. coli MG1655 pCON. 2. Monitoramento de bactérias portadoras de plasmídeos várias condições ao longo do tempo NOTA: O experimento de evolução é conduzido com cepas de transporte de plasmídeos em condições não seletivas (mídia LB) em duas temperaturas (37 °C e 20 °C) e três tamanhos de gargalo populacional. O projeto experimental é usado para estudar a persistência plasmídeo várias circunstâncias. Projeto de um experimento de evolução para acompanhar a frequência plasmídea ao longo do tempo(Figura 2) Placa a cepa de transporte de plasmídeo construída(E. coli MG1655 pCON) em placas de ágar LB complementadas com antibióticos (kanamicina 25 μg/mL) e incubada durante a noite a 37 °C. Prepare 96 placas de poço profundo com 1 mL de lb médio em cada poço. Como os ancestrais bacterianos, escolha oito colônias aleatórias isoladas da placa ágar em poços independentes. Incubar as placas a 37 °C e 450 rpm em uma placa shaker por 24 h. Prepare um estoque congelado de glicerol dos clones ancestrais. No dia seguinte, transferir as oito populações replicar em novas placas de poço profundo de acordo com o projeto experimental (Figura 2). As culturas são diluídas 1:100 (gargalo grande, L), 1:1,000 (gargalo médio, M), ou 1:10,000 (pequeno gargalo, S) em um volume total de 1 mL LB usando PBS para diluição. As culturas diluídas são incubadas a 37 °C e 20 °C.NOTA: É muito importante controlar a contaminação cruzada na placa de 96 poços profundos. Assim, use um design de placa de xadrez intercalando poços inoculados com meio LB livre de bactérias. Use esse padrão através de todo o experimento de evolução. As culturas incubadas a 37 °C são transferidas a cada 12 h, enquanto as culturas a 20 °C são transferidas a cada 24 h.NOTA: Durante cada evento de transferência, o tratamento de tamanho de gargalo é aplicado e a transferência em série é repetida ao longo de um total de 98 transferências. O número de transferências dependerá do design experimental dos leitores. Prepare um estoque congelado de glicerol de todas as populações regularmente, 2x por semana. Monitoramento da frequência plasmírica por revestimento de réplicas (Figura 3)NOTA: Durante o experimento de evolução, a frequência de células portadoras de plasmídeos na população é estimada a partir da proporção de hospedeiros. O protocolo de revestimento de réplica é mostrado na Figura 3. Para determinar a frequência plasmídea na população durante o experimento de evolução, as culturas estacionárias são em série diluídas e banhadas em placas de ágar LB não seletivas. Ajuste a diluição de acordo com um rendimento de 250-500 colônias por placa.NOTA: Prepare placas grossas do ágar de LB antes do revestimento (~30 ágar do mL). As populações banhadas são incubadas para o crescimento durante a noite de acordo com sua temperatura de crescimento no experimento.NOTA: As colônias precisam ser pequenas, assim incubam <24 h a 37 °C. Após o crescimento durante a noite, contar todas as colônias usando uma estação manual ou automática contagem de colônias e calcular o tamanho total da população bacteriana nas culturas.NOTA: Colônias na borda da placa ágar não devem ser incluídas na contagem total de células bacterianas. Esterilizar peças quadradas (~20 x 20 cm) de veludo de algodão por autoclismo.NOTA: O pano de veludo precisa ser 100% algodão para ser autoclavável. É importante secar o pano após a esterilização. Após a esterilização do pano de veludo, coloque o pano em um bloco redondo e corrigi-lo com um anel de metal. É crucial para evitar rugas. Coloque cuidadosamente a placa com as colônias cultivadas (ágar voltada para baixo) na superfície de pano de veludo fixo. Certifique-se de que todas as colônias tocam a superfície de veludo tocando cuidadosamente na placa de Petri de forma circular. Retire cuidadosamente a placa de ágar LB e coloque uma placa seletiva complementada com antibióticos (kanamicina 25 μg/mL) no pano de veludo. Certifique-se que a placa está tocando todo o veludo com cuidado batendo na placa de Petri como descrito antes. Depois, retire a placa. Deixe as placas à temperatura ambiente para o crescimento durante a noite. No dia seguinte, avalie a placa de ágar LB e a placa seletiva. Colônias que crescem na mídia seletiva são contadas como hospedeiros plasmid (ou seja, resistentes a antibióticos), enquanto os pontos livres de colônias são colônias que eram livres de plasmídeos e, portanto, não são resistentes ao antibiótico (ou seja, perdeu o plasmídeo). Isso é feito colocando as placas umasobre a outra e comparando o crescimento (ou seja, marque todas as colônias desaparecidas) e contando o número da colônia em ambas as placas. Isso produz o número de células que perderam o plasmídeo durante o experimento de evolução. Repita este procedimento ao longo de todo o experimento de evolução de forma regular (por exemplo, a cada 14 transferências). 3. Visualização de multimers plasmídeos usando eletroforese de gel NOTA: Plasmid extração de plasmídeos de baixa cópia muitas vezes leva à contaminação com o DNA cromossômico hospedeiro que precisa ser enzimaticamente digerido antes da visualização. Extraia dna plasmite de uma cultura de células estacionárias de 5 mL usando lonina alcalina, conforme descrito no passo 1.5. Posteriormente, trate o DNA plasmínico extraído com um DNase dependente de ATP que só corta dna cromossômico para remover a contaminação cromossômica de DNA (ver Tabela de Materiais). Incubar a 37 °C por 30 min. Depois, limpar o DNA usando um kit de sua escolha. Para criar moléculas de círculo aberto de todas as conformações plasmáticas (monomers ou multimers), incubar as amostras de DNA plasmídeo com uma enzima de corte (Nb.BsrDI) e incubar por 30 min a 65 °C. Paralelamente, para criar moléculas de plasmídeos lineares (ou seja, para comparação de tamanho plasmídeo), use uma enzima de restrição de sua escolha (por exemplo, HindIII) que cede o plasmídeo uma vez.NOTA: Isso resulta em monomers lineares de dna plasmid. Moléculas de círculo aberto não migram de forma linear. Para visualizar o tamanho plasmínico e conformação, eletroforrese as amostras de DNA plasmídeo cortado e linear para 120 min em 4,3 V / cm em um 1% (w / v) agarose gel e 1× TAE buffer. As amostras são manchadas com verde Midori e o gel é visualizado em um sistema de imagem gel (ver Tabela de Materiais). Use uma escada de 1 kbp.