Generazione di organoidi mammari mosaici per provepsinizzazione differenziale

La ghiandola mammaria (MG) è una struttura epiteliale tubolare simile ad un albero incorporata all’interno di uno stroma ricco di adipociti. L’epitelio duttale bistrato comprende uno strato basale esterno e basale di contratture, cellule mioepiteliali (MyoEC) e uno strato interno di cellule epiteliali luminali e secretorie (LEC), che circondano un lumaro centrale¹. Durante l’allattamento, quando i myoEC esterni si contraggono per spremere il latte dai LEC dell’alveolar interno, la MG subisce numerosi cambiamenti che sono sotto il controllo dei fattori di crescita (ad esempio, EGF e FGF) e degli ormoni (ad esempio progne, insulina e prolattina). Questi cambiamenti causano la differenziazione delle strutture specializzate, gli alveoli, che sintetizzano e secernono il latte durante l’allattamento¹. L’epitelio mammario può essere manipolato sperimentalmente utilizzando tecniche in cui sia frammenti di tessuto epiteliale, cellule, o anche una singola cellula basale vengono trapiantati in cuscinetti di grasso mammari ospiti, precleared di parenchyma mammario endogeno, e lasciato crescere per ricostituire un intero albero epileliale funzionale^2,3,4,5. Il trapianto è una tecnica potente, ma richiede tempo e impossibile se una mutazione si traduce in una prima letalità embrionale (prima dell’E14) che impedisce il salvataggio dell’anlage mammario trapiantabile. Inoltre, i ricercatori desiderano spesso ricercare i ruoli dei due diversi comparti, che derivano da cellule progenitrici soggette a restrizioni di lignaggio. Mentre la tecnologia Cre-lox consente la manipolazione genetica differenziata di myoEC e LEC, questa è anche un’impresa lunga e costosa. Così, fin dagli anni ’50, gli investigatori hanno usato organoidi mammari in vitro come un modo relativamente semplice ed efficiente per affrontare le questioni riguardanti la struttura e la funzione del tessuto mammario^6,7.

Nei primi protocolli che descrivono l’isolamento e la coltura delle cellule epiteliali mammarie primarie, i ricercatori hanno scoperto che una matrice di membrana seminterrato (BME), composta da un coagulo di plasma ed estratto di embrione di pollo, era necessaria per frammenti di MG coltivati su un piatto⁶. Nei decenni successivi, le matrici extracellulari (ECU, collagene e matrice proteica gelatina secreta dalle cellule del sarcoma murino di Engelbreth-Holm-Swarm) sono state sviluppate per facilitare la coltura 3D e imitare meglio l’ambiente in vivo^7,8,9,10. Cellule cullanti in matrici 3D hanno rivelato da molteplici criteri (morfologia, espressione genica e reattività ormonale) che un tale microambiente migliori modelli in vivo fisiologici processi fisiologici^9,10,11,12. La ricerca sulle cellule murine primarie ha identificato i fattori di crescita chiave e i morfogeni necessari per la manutenzione prolungata e la differenziazione degli organoidi¹³. Questi studi hanno posto le basi per il protocollo qui presentato, e per la coltura delle cellule mammarie umane come organoidi 3D, che è ora uno strumento clinico moderno, consentendo la scoperta di farmaci e test farmacologici su campioni di pazienti¹⁴. Nel complesso, la coltura organoide mette in evidenza le capacità di auto-organizzazione delle cellule primarie e il loro contributo alla morfogenesi e alla differenziazione.

Presentato qui è un protocollo alla cultura murine epitelia che può essere differenziato in acini di produzione di latte. Una tecnica di prova differenziale viene utilizzata per isolare i MyoEC e i LEC che compongono i due distinti compartimenti delle cellule MG. Queste frazioni cellulari separate possono quindi essere geneticamente manipolate per sovraesprimere o abbattere la funzione genica. Poiché lignaggio-intrinseco, l’auto-organizzazione è una proprietà innata delle cellule epiteliali mammarie^15,16,17, ricombinando queste frazioni cellulari permette ai ricercatori di generare organoidi bistrato. Iniziamo digerindo enzimaticamente il tessuto adiposo, e poi incubando i frammenti mammari su un piatto di coltura dei tessuti per 24 h (Figura 1). I frammenti di tessuto si depositano su piatti di polistirolo come frammenti bistrato con la loro organizzazione in vivo: strato mioeelistiale esterno che circonda strati luminali interni. Questa organizzazione cellulare consente l’isolamento dei MyoEC esterni da trypsin-EDTA (0,05%) trattamento per 3-6 min seguito da un secondo giro di trippsina-EDTA (0,05%) trattamento che stacca i restanti LEC interni (Figura 2). Pertanto, questi tipi di cellule con diversa sensibilità alla trypsina sono isolati e possono essere successivamente miscelati e placcati in ECM (Figura 3). Le cellule si sottopono all’auto-organizzazione per formare sfere a scansione, che comprendono uno strato esterno di MyoEC che circondano i LEC interni. La formazione del lume si verifica quando le cellule crescono in un mezzo contenente un cocktail di fattori di crescita (vedi ricette per Mezzo di crescita)¹³. Dopo 5 giorni, gli organoidi possono essere differenziati in acini che producono latte passando all’Alveologenesi Medium (vedi ricette e Figura 3F)e incubati per altri 5 giorni. In alternativa, gli organoidi continueranno ad espandersi e a ramificarsi in Growth Medium per almeno 10 giorni. Gli organiidi possono essere analizzati utilizzando l’immunofluorescenza (Figura 3D-F) o rilasciati dall’ECM utilizzando una soluzione di recupero (cfr. tabella dei materiali)e analizzati tramite altri metodi (ad esempio, immunoblot, RT-qPCR).