Generación de organoides mamarios de mosaico por trippsinización diferencial

La glándula mamaria (MG) es una estructura epitelial tubular similar a un árbol incrustada dentro de un estroma rico en adipocitos. El epitelio ductal bicapado comprende una capa externa basal de células contráctil, mioepiteliales (MyoEC) y una capa interna de células epiteliales luminarias y secretoras (LEC), que rodea un lumen central¹. Durante la lactancia cuando los MyoECexternos externos se contraen para exprimir la leche de los LEC alveolares internos, la MG sufre numerosos cambios que están bajo el control de factores de crecimiento (por ejemplo, EGF y FGF) y hormonas (por ejemplo, progesterona, insulina y prolactina). Estos cambios causan la diferenciación de las estructuras especializadas, alvéolos, que sintetizan y secretan la leche durante la lactancia¹. La epitelía mamaria puede ser manipulada experimentalmente utilizando técnicas en las que los fragmentos de tejido epitelial, las células o incluso una sola célula basal se trasplantan en almohadillas de grasa mamaria del huésped, precleares del parénquima mamario endógeno, y se les permite crecer para reconstituir un árbol epitelial completo y funcional^2,,3,4,5. El trasplante es una técnica poderosa, pero es lenta e imposible si una mutación resulta en una letalidad embrionaria temprana (antes de E14) que evita el rescate del anlage mamario trasplanible. Además, los investigadores con frecuencia desean investigar las funciones de los dos compartimentos diferentes, que se derivan de células progenitoras restringidas al linaje. Si bien la tecnología Cre-lox permite la manipulación genética diferencial de myoECs y LECs, también es una tarea costosa y que consume mucho tiempo. Así, desde la década de 1950, los investigadores han utilizado organoides mamarios in vitro como una manera relativamente fácil y eficiente de abordar cuestiones relativas a la estructura y función del tejido mamario^6,7.

En los primeros protocolos que describen el aislamiento y el cultivo de células epiteliales mamarias primarias, los investigadores encontraron que se requería una matriz de membrana de sótano (BME), compuesta por un coágulo plasmático y extracto de embrión de pollo, para los fragmentos de MG cultivados en un plato^6. En las décadas siguientes, se desarrollaron matrices extracelulares (ECM, colágeno y matriz proteica gelatinosa secretada por células de sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm) para facilitar el cultivo 3D e imitar mejor el entorno in vivo^7,,8,9,10. Células de cultivo en matrices 3D reveladas por múltiples criterios (morfología, expresión génica y capacidad de respuesta hormonal) que tal microambiente modela mejor los procesos fisiológicos vivos^9,10,11,12. La investigación utilizando células murinas primarias identificó factores clave de crecimiento y morógenos necesarios para el mantenimiento extendido y la diferenciación de organoides^13. Estos estudios han establecido el escenario para el protocolo presentado aquí, y para el cultivo de células mamarias humanas como organoides 3D, que ahora es una herramienta clínica moderna, lo que permite el descubrimiento de fármacos y pruebas de drogas en muestras de pacientes¹⁴. En general, el cultivo organoide retocomodo pone de relieve las capacidades de autoorganización de las células primarias y sus contribuciones a la morfogénesis y diferenciación.

Presentado aquí es un protocolo para el cultivo de la epitelia murina que se puede diferenciar en acini productor de leche. Se utiliza una técnica de tripinización diferencial para aislar los MyoECs y LEC que componen los dos compartimentos celulares MG distintos. Estas fracciones celulares separadas pueden ser manipuladas genéticamente para sobreexpresar o derribar la función genética. Debido a que el linaje-intrínseco, la autoorganización es una propiedad innata de las células epiteliales mamarias^15,16,17, la recombinación de estas fracciones celulares permite a los investigadores generar bicapas, organoides de mosaico. Comenzamos digiriendo enzimáticamente el tejido adiposo, y luego incubando los fragmentos mamarios en un plato de cultivo de tejido durante 24 h(Figura 1). Los fragmentos de tejido se asientan sobre platos de poliestireno como fragmentos bicapados con su organización in vivo: capa mioepitelial exterior que rodea las capas luminales internas. Esta organización celular permite el aislamiento de los MyoECexternos externos por trippsina-EDTA (0,05%) tratamiento durante 3-6 min seguido de una segunda ronda de trypsin-EDTA (0,05%) tratamiento que separa los LEC internos restantes(Figura 2). Por lo tanto, estos tipos de células con diferente sensibilidad a la trippsina se aíslan y posteriormente se pueden mezclar y chapar en ECM(Figura 3). Las células se someten a una autoorganización para formar esferas bicapas, que comprenden una capa externa de Micmy que rodean los LEC internos. La formación de lúmenes se produce a medida que las células crecen en un medio que contiene un cóctel de factores de crecimiento (ver recetas para el medio de crecimiento)¹³. Después de 5 días, los organoides se pueden diferenciar en acini productores de leche cambiando a Medio de Alveologénesis (ver recetas y Figura 3F)e incubados durante otros 5 días. Alternativamente, los organoides continuarán expandiéndose y ramificándose en el Medio de Crecimiento durante al menos 10 días. Los organoides pueden analizarse utilizando inmunofluorescencia(Figura 3D-F)o liberarse del ECM utilizando una solución de recuperación (ver Tabla de Materiales)y analizarse a través de otros métodos (por ejemplo, inmunoblot, RT-qPCR).