Generierung von Mosaik-Mammary-Organoiden durch Differential-Trypsinisierung

Die Brustdrüse (MG) ist eine baumartige, röhrenförmige Epithelstruktur, die in eine adipozytenreiche Stroma eingebettet ist. Das zweischichtige duktale Epithel besteht aus einer äußeren, basalen Schicht aus kontraktilen, myoepithelialen Zellen (MyoECs) und einer inneren Schicht aus luminalen, sekretorischen Epithelzellen (LECs), die ein zentrales Lumen^{umschließen 1}. Während der Stillzeit, wenn sich die äußeren MyoECs zusammenschließen, um Milch aus den inneren alveolarLECs zu pressen, erfährt das MG zahlreiche Veränderungen, die unter der Kontrolle von Wachstumsfaktoren (z. B. EGF und FGF) und Hormonen (z. B. Progesteron, Insulin und Prolaktin) stehen. Diese Veränderungen verursachen die Differenzierung von spezialisierten Strukturen, Alveolen, die Milch während der Laktation¹synthetisieren und absondern. Die Brustepithelie kann experimentell mit Techniken manipuliert werden, bei denen entweder Epithelgewebefragmente, Zellen oder sogar eine einzelne Basalzelle in Brustfettpolster transplantiert, von endogenem Brustparenchym vorgereinigt und auswachsen lassen, um einen ganzen, funktionellen Epithelbaum^2,3,4,5zu rekonstruieren. Transplantation ist eine leistungsfähige Technik, aber es ist zeitaufwändig und unmöglich, wenn eine Mutation zu einer frühen embryonalen Letalität (vor E14) führt, die die Rettung von transplantierbaren Brustanlagen verhindert. Darüber hinaus möchten die Forscher häufig die Rollen der beiden verschiedenen Kompartimente erforschen, die aus linienbeschränkten Vorläuferzellen abgeleitet sind. Während die Cre-lox-Technologie die differenzielle genetische Manipulation von MyoECs und LECs ermöglicht, ist dies auch ein zeitaufwändiges und teures Unterfangen. So haben die Forscher seit den 1950er Jahren In-vitro-Mammariide als relativ einfache und effiziente Möglichkeit verwendet, Um Fragen zur Brustgewebestruktur und -funktion^6,7zu beantworten.

In frühen Protokollen, die die Isolierung und Kultur der primären Epithelzellen der Brust beschreiben, fanden die Forscher heraus, dass eine Kellermembranmatrix (BME), bestehend aus einem Plasmagerinnsel und Einem Hühnerembryonalextrakt, für MG-Fragmente erforderlich war, die auf einer Schale⁶angebaut wurden. In den folgenden Jahrzehnten wurden extrazelluläre Matrizen (ECMs, Kollagen und geleeartige Proteinmatrix, die von Engelbreth-Holm-Swarm-Murine-Sarkomzellen sezerniert wurden) entwickelt, um die 3D-Kultur zu erleichtern und die in vivo-Umgebung^7,8,9,10” besser nachzuahmen. Culturing Zellen in 3D-Matrizen durch mehrere Kriterien (Morphologie, Genexpression und Hormonreaktion) offenbart, dass eine solche Mikroumgebung besser Modelle in vivo physiologische Prozesse^9,10,11,12. Die Forschung mit primären murinen Zellen identifizierte wichtige Wachstumsfaktoren und Morphogene, die für die erweiterte Erhaltung und Differenzierung von Organoiden notwendig sind¹³. Diese Studien haben die Voraussetzungen für das hier vorgestellte Protokoll und für die Kultur menschlicher Brustzellen als 3D-Organoide bereitet, die heute ein modernes klinisches Werkzeug ist, das die Entdeckung von Arzneimitteln und Arzneimitteltests an Patientenproben^{ermöglicht 14}. Insgesamt hebt die organoide Kultivierung die Selbstorganisationskapazitäten von Primärzellen und ihre Beiträge zur Morphogenese und Differenzierung hervor.

Präsentiert hier ist ein Protokoll zu Kultur murin epithelia, die in Milch produzierenden Acini unterschieden werden kann. Eine differenzielle Trypsinisierungstechnik wird verwendet, um die MyoECs und LECs zu isolieren, aus denen die beiden unterschiedlichen MG-Zellkompartimente bestehen. Diese getrennten Zellfraktionen können dann genetisch manipuliert werden, um die Genfunktion zu überexpressen oder zu klopfen. Da die Linienintrinsinin, die Selbstorganisation eine angeborene Eigenschaft der Epithelzellen der Brust^15,16,17ist, ermöglicht die Rekombination dieser Zellfraktionen den Forschern, bilayerierte Mosaik-Organoide zu erzeugen. Wir beginnen damit, das Fettgewebe enzymatisch zu verdauen und dann die Brustfragmente auf einer Gewebekulturschale für 24 h zu inkubieren (Abbildung 1). Die Gewebefragmente setzen sich auf Polystyrolschalen als zweischichtige Fragmente mit ihrer In-vivo-Organisation ab: äußere myoepitheliale Schicht, die innere Luminalschichten umgibt. Diese zelluläre Organisation ermöglicht die Isolierung der äußeren MyoECs durch Trypsin-EDTA (0,05%) Behandlung für 3-6 min gefolgt von einer zweiten Runde Trypsin-EDTA (0,05%) Behandlung, die die verbleibenden inneren LECs löst (Abbildung 2). Somit werden diese Zelltypen mit unterschiedlicher Trypsinempfindlichkeit isoliert und können anschließend in ECM gemischt und plattiert werden (Abbildung 3). Die Zellen durchlaufen eine Selbstorganisation, um zweischichtige Kugeln zu bilden, die eine äußere Schicht von MyoECs umgeben, die innere LECs umgeben. Lumenbildung tritt auf, wenn die Zellen in einem Medium wachsen, das einen Cocktail von Wachstumsfaktoren enthält (siehe Rezepte für Growth Medium)¹³. Nach 5 Tagen können Organoide durch Umschalten auf Alveologenese Medium (siehe Rezepte und Abbildung 3F)in milchproduzierende Acini differenziert und für weitere 5 Tage inkubiert werden. Alternativ werden Organoide für mindestens 10 Tage weiter expandieren und in Growth Medium verzweigen. Organoide können mit Immunfluoreszenz (Abbildung 3D-F) analysiert oder aus dem ECM mit einer Wiederherstellungslösung freigesetzt werden (siehe Materialtabelle) und mit anderen Methoden (z. B. Immunoblot, RT-qPCR) analysiert werden.