جيل من الأرغن مامري الفسيفساء عن طريق التربسينات التفاضلية
Summary
الغدة الثديية هي بنية ثنائية الطبقات ، تتألف من الخلايا الظهارية الداخلية والداخلية. قدم هو بروتوكول لإعداد organoids باستخدام التربسينات التفاضلية. تسمح هذه الطريقة الفعالة للباحثين بالتلاعب بشكل منفصل مع هذين النوعين من الخلايا لاستكشاف الأسئلة المتعلقة بأدوارهم في شكل الغدة الثديية ووظيفتها.
Abstract
تقدم الأرغن ذاتية التنظيم وهياكل الأنسجة ثلاثية الأبعاد التي تلخص العمليات الفسيولوجية في راحة الطبق. تتكون الغدة الثديية المورين من غرفتين منفصلتين للخلايا الظهارية متميزة ، تخدم وظائف مختلفة: المقصورة الخارجية ، الانحلال myoepithelial والمقصورة المضيئة الداخلية الإفرازية. هنا ، نصف طريقة يتم من خلالها عزل الخلايا التي تتألف من هذه الأجزاء ثم دمجها للتحقيق في مساهماتها الفردية في تكوين الغدة الثديية والتمايز. الطريقة بسيطة وفعالة ولا تتطلب تقنيات فصل متطورة مثل فرز الخلايا المنشطة الفلورية. بدلا من ذلك، نحن الحصاد وهضم الأنسجة أنزيمي، بذور ظهارة على أطباق زراعة الأنسجة المنضمة، ومن ثم استخدام التربسال التفاضلية لفصل myoepithelial من الخلايا المضيئة مع ~ 90٪ نقاء. ثم يتم طلاء الخلايا في مصفوفة خارج الخلية حيث تنظم في عضويات ثنائية الأبعاد (3D) يمكن تمييزها لإنتاج الحليب بعد 10 أيام في الثقافة. لاختبار آثار الطفرات الوراثية، يمكن حصاد الخلايا من النوع البري أو نماذج الماوس المعدلة وراثيا، أو يمكن التلاعب بها وراثيا قبل الثقافة ثلاثية الأبعاد. ويمكن استخدام هذه التقنية لتوليد الأورجادات الفسيفساء التي تسمح بالتحقيق في وظيفة الجينات على وجه التحديد في المقصورة المضيئة أو الميوبيلية.
Introduction
الغدة الثديية (MG) هي بنية ظهارية أنبوبية تشبه الشجرة وجزءاً لا يتجزأ من ستروما الغنية بالخلايا الشحمية. تتكون ظهارة القناة ثنائية الطبقات من طبقة خارجية وبازلية من الانقباض والخلايا العضلة المتوسطة (MyoECs) وطبقة داخلية من الخلايا الظهارية الظهارية الظهارية المضيئة (LECs) ، وتطويق تجويف مركزي1. أثناء الرضاعة عندما تعاقدت MyoECs الخارجية على ضغط الحليب من الليكل السنخيالداخلي ، يخضع MG للعديد من التغييرات التي تخضع لسيطرة عوامل النمو (مثل EGF و FGF) والهرمونات (مثل البروجسترون والأنسولين والبرولاكتين). هذه التغيرات تسبب التمايز من الهياكل المتخصصة، الحويصلات الهوائية، والتي توليف وإفراز الحليب أثناء الرضاعة1. يمكن التلاعب بظهارة الثدي بشكل تجريبي باستخدام التقنيات التي يتم فيها إما زرع شظايا الأنسجة الظهارية أو الخلايا أو حتى خلية القاعدية واحدة في منصات الدهون الثديية المضيفة ، وتطهيرها مسبقًا من parenchyma الثديية الذاتية ، والسماح لها بالنمو لإعادة تشكيل شجرة ظهارية وظيفية كاملة2،3،4،5. الزرع هو تقنية قوية، ولكن من الصعب أن تستغرق وقتا طويلا والمستحيل إذا طفرة النتائج في وقت مبكر من الفتك الجنينية (قبل E14) التي تمنع إنقاذ الانج الثديية القابلة للزرع. وعلاوة على ذلك، يرغب المحققون في كثير من الأحيان في البحث عن أدوار الجزأين المختلفين، المستمدين من خلايا السلف المقيدة بالنسب. في حين أن تكنولوجيا Cre-lox تسمح بالتلاعب الجيني التفاضلي لـ MyoECs و LECs ، فإن هذا أيضًا مهمة تستغرق وقتًا طويلاً ومكلفة. وهكذا ، منذ 1950s ، وقد استخدم المحققون في المختبر organoids الثديية كوسيلة سهلة نسبيا وفعالة لمعالجة المسائل المتعلقة بنية الأنسجة الثديية وظيفة6،7.
في البروتوكولات المبكرة التي تصف عزلة وثقافة الخلايا الظهارية الثديية الأولية ، وجد المحققون أن مصفوفة غشاء الطابق السفلي (BME) ، المكونة من جلطة بلازما واستخراج جنين الدجاج ، كانت مطلوبة لشظايا MG التي تزرع على طبق6. في العقود التالية ، تم تطوير المصفوفات خارج الخلية (ECMs ، الكولاجين ، ومصفوفة البروتين هلامي تفرزها خلايا ساركوما Murine Engelbreth-Holm-Swarm) لتسهيل الثقافة ثلاثية الأبعاد وتقليد أفضل في بيئة الجسم الحي7،8،9،10. الخلايا التهيئة في مصفوفات 3D كشفت عن معايير متعددة (مورفولوجيا، والتعبير الجيني، واستجابة الهرمونات) أن مثل هذه البيئة الدقيقة نماذج أفضل فيالعملياتالفسيولوجية الجسم 9،10،11،12. حددت الأبحاث باستخدام خلايا المورين الأولية عوامل النمو الرئيسية ومورفوجينات ضرورية للصيانة الموسعة والتمايز للorganoids13. وقد مهدت هذه الدراسات الطريق للبروتوكول المعروض هنا ، وثقافة خلايا الثدي البشرية وorganoids 3D ، والتي هي الآن أداة سريرية حديثة ، مما يسمح لاكتشاف المخدرات واختبار المخدرات على عينات المريض14. وعموما، يبرز الاستزراع اللواني العضوي قدرات التنظيم الذاتي للخلايا الأولية ومساهماتها في تكوين المورفوجينية والتمايز.
عرض هنا هو بروتوكول لثقافة الظهارة المورين التي يمكن تمييزها في acini المنتجة للحليب. يتم استخدام تقنية التربسة التفاضلية لعزل MyoECs و LECs التي تضم مقصورتي خلية MG متميزتين. ويمكن بعد ذلك أن يتم التلاعب بكسور الخلايا المنفصلة هذه وراثياً إلى وظيفة جينية مفرطة أو ضربة قاضية. لأن النسب الجوهرية، والتنظيم الذاتي هو خاصية فطرية من الخلايا الظهارية الثديية15،16،17، وإعادة دمج هذه الكسور الخلية يسمح للباحثين لتوليد ثنائي الطبقات، والأجهزة الفسيفسائية. نبدأ بهضم الأنسجة الدهنية بشكل أنزيمي ، ثم احتضان شظايا الثديية على طبق زراعة الأنسجة لمدة 24 ساعة(الشكل 1). تستقر شظايا الأنسجة على أطباق البوليسترين كأجزاء ثنائية الطبقات مع تنظيمها في الجسم الحي: طبقة عضلة العين الخارجية المحيطة بالطبقات المضيئة الداخلية. هذه المنظمة الخلوية يسمح لعزل MyoECs الخارجي عن طريق التربسين EDTA (0.05٪) العلاج لمدة 3-6 دقيقة تليها الجولة الثانية من التربسين-EDTA (0.05%). العلاج الذي يفصل LECs الداخلية المتبقية(الشكل 2). وهكذا، يتم عزل هذه الأنواع من الخلايا مع حساسية التربسين مختلفة ويمكن لاحقا أن تكون مختلطة ومطلي في ECM(الشكل 3). وتخضع الخلايا للتنظيم الذاتي لتشكيل مجالات ثنائية الطبقات، تتألف من طبقة خارجية من MyoECs المحيطة بمراكز التجارة المنخفضة الداخلية. تشكيل لومن يحدث كما تنمو الخلايا في وسط يحتوي على مزيج من عوامل النمو (انظر وصفات للنمو المتوسط)13. بعد 5 أيام ، يمكن تمييز الأورجادات الاعضاء في acini المنتجة للحليب عن طريق التحول إلى Alveologenesis Medium (انظر الوصفات والشكل 3F)واحتضانها لمدة 5 أيام أخرى. بدلا من ذلك، سوف تستمر الorganoids للتوسع وفرع في النمو المتوسطة لمدة 10 أيام على الأقل. يمكن تحليل الأرغن باستخدام الفلورة المناعية(الشكل 3D-F)أو تحريرها من ECM باستخدام محلول الاسترداد (انظر جدول المواد)وتحليلها عبر طرق أخرى (على سبيل المثال، المناعة، RT-qPCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، يتم تقديم طريقة بالتفصيل كيف يمكن للباحثين توليد الثقافات الاعضاء 3D باستخدام خلايا MG الأولية. الفرق بين هذا والبروتوكولات الأخرى هو أننا بالتفصيل طريقة لفصل اثنين، متميزة مقصورات الخلية MG: MyoECs القاعدية الخارجية وLECs الداخلية. تستخدم طريقتنا تريبسين-EDTA من خطوتين (0.05%) العلاج الذي نسمي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر بن أبرامز على المساعدة التقنية والدعم الأساسي من معهد جامعة كاليفورنيا في سانتا كروز لبيولوجيا الخلايا الجذعية (IBSC). نشكر سوزان ستروم وبيل ساكستون لاستخدام Solamere الغزل القرص المجهر كونكورسي. تم دعم هذا العمل جزئيًا من خلال المنح المقدمة إلى UCSC من معهد هوارد هيوز الطبي من خلال زمالات جيمس جيليام للدراسة المتقدمة (S.R.) ، من المعاهد القومية للصحة (NIH GM058903) لمبادرة تحقيق أقصى قدر من تنمية الطلاب (H.M. ومن المؤسسة الوطنية للعلوم للحصول على زمالة أبحاث الدراسات العليا (O.C. DGE 1339067) ومنحة (A18-0370) من لجنة تنسيق أبحاث السرطان في جامعة كاليفورنيا (LH).
Materials
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
References
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
- Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
- Ip, M. M., Asch, B. B. . Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , (2000).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
- Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
- Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
- Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message?. Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207 (2016).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).
- Runswick, S. K., O’Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).
- Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
- Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
- Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).
- Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).
- Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
- Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).
