הדור של הפסיפס של חלב באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית
Summary
בלוטת החלב היא מבנה מחודד, המורכב מיואפיתל חיצוני ותאי אפיתל הפנים הפנימיים. המוצג הוא פרוטוקול להכין אורגנואידים. באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית שיטה יעילה זו מאפשרת לחוקרים לטפל באופן נפרד בשני סוגי תאים אלה כדי לחקור שאלות הנוגעות לתפקידם בצורת בלוטת החלב ובתפקוד.
Abstract
בארגון אורגנואידים מציעים מבני רקמה תלת-ממדיים המתארגנים תהליכים פיזיולוגיים בנוחות של מנה. בלוטת החלב מורין מורכבת משני תאים שונים האפיתל תאים, המשרתים פונקציות שונות: החיצוני, תא האפיתל מיוטורי ואת התא הפנימי, הפרשה לומיאל. כאן, אנו מתארים שיטה שבה התאים המרכיבים תאים אלה מבודדים ולאחר מכן משולבים כדי לחקור את התרומה האישית שלהם השושלת כדי בלוטת החלב מורפולגנזה ובידול. השיטה היא פשוטה ויעילה ואינה מצריכה טכנולוגיות הפרדה מתוחכמות כגון מיון תאים המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית. במקום זאת, אנו הקציר ו אנזימטי מעכל את הרקמה, הזרע את האפיתל על מנות תרבות הרקמה מחסיד, ולאחר מכן להשתמש טריסיזציה דיפרנציאל הפרדה מיואפיתל מתאי הלומיאלים עם ~ 90% טוהר. התאים מצופים לאחר מכן במטריצה מחלבת שם הם מסדרים לתוך בילדו, תלת מימדי (3D) אורגנואידים כי ניתן לבדיל כדי לייצר חלב לאחר 10 ימים בתרבות. כדי לבדוק את ההשפעות של מוטציות גנטיות, תאים ניתן לקצור מסוג פראי או מהונדסים גנטית מודלים העכבר, או שהם יכולים להיות מניפולציות גנטית לפני התרבות 3D. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי ליצור אורגנואידים פסיפס המאפשרים חקירה של הפונקציה גן במיוחד ב הלומיאל או מיואפיתל התא.
Introduction
בלוטת החלב (MG) היא כמו עץ, מבנה האפיתל הצינורי המוטבע בתוך משתית עשיר אדיפוציטוטה. האפיתל הביקטיום כולל שכבת הבסיס החיצונית של כריתת המעטפת, תאי האפיתל (מיואקאס) ושכבה פנימית של לומיאל, תאי אפיתל הפרשה (LECs), המקיף לומן מרכזי1. במהלך ההנקה כאשר החוזה החיצוני מיוקל לסחוט חלב מכתשיים למדעי הפנים, ה-MG עובר שינויים רבים הנמצאים תחת שליטתה של גורמי גדילה (למשל, EGF ו-FGF) והורמונים (למשל פרוגסטרון, אינסולין, ו prolactin). שינויים אלה גורמים לבידול של מבנים מיוחדים, מכתשי, אשר מסנתז ומפרישות חלב במהלך ההנקה1. אפיטאליה של הפטמות יכול להיות מניפולציות בשיטות שבהן שברי רקמת אפיתל, תאים, או אפילו תא בסיס אחד מושתלים לתוך מארח מגיני שומן בחלב, מראש על הפטמות של החלב אנדוסוגני, ומותר לגדול כדי להוות מחדש שלמות, עץ אפיתל פונקציונלי2,3,4,5. השתלת היא טכניקה רבת עוצמה, אבל זה זמן רב ובלתי אפשרי אם תוצאות מוטציה בתוך החיים העובריים המוקדמים (לפני E14) המונע הצלה של שתילת שולחן החלב. יתרה מזאת, חוקרים מבקשים לעתים תכופות לחקור את תפקידם של שני התאים השונים, הנגזרים מתאי השושלת המוגבלים. בעוד טכנולוגיית היצור-לקס מאפשר מניפולציה גנטית דיפרנציאלית של מיויואס ו-LECs, זה גם משימה גוזלת זמן ויקר. לפיכך, מאז שנות החמישים, החוקרים השתמשו באורגנואידים מחוץ לבית הספר כדרך קלה ויעילה יחסית לטיפול בשאלות הנוגעות למבנה רקמת החלב ולתפקוד6,7.
בפרוטוקולים המוקדמים המתארים את הבידוד והתרבות של תאי האפיתל הראשוניים של החלב, החוקרים מצאו כי מטריצת קרום המרתף (BME), מורכב קריש פלזמה והעובר לחלץ עוף, נדרש עבור שברי MG גדל על מנה6. בעשורים הבאים, מטריצות של מסחטות (ecms, קולגן, ו מדוזות חלבון מטריצה מופרש על ידי אנגלברב-הולם-נחיל מורטין בתאי סרקומה) פותחו כדי להקל על תרבות 3d ולחקות טוב יותר בסביבה vivo7,8,9,10. תאים culturing בתוך 3d מטריצות מתגלים על ידי קריטריונים מרובים (מורפולוגיה, ביטוי גנים, ואת התגובה הורמון) כי כזה מיקרוסביבה מודלים טובים יותר vivo תהליכים פיזיולוגיים9,10,11,12. מחקר באמצעות תאים murine העיקרי זיהה גורמי צמיחה מפתח מורפולגנים הדרושים תחזוקה מורחבת והבידול של אורגנואידים13. מחקרים אלה קבעו את הבמה לפרוטוקול המוצג כאן, ולתרבות של תאי השדיים האנושיים כמו אורגנואידים 3D, אשר כיום הוא כלי קליני מודרני, המאפשר גילוי סמים ובדיקות סמים על דגימות החולה14. בסך הכל, אורגנואיד culturing מדגיש את היכולות של הארגון העצמי של התאים הראשוניים ואת תרומתם לורפוגנזה ובידול.
מוצג כאן הוא פרוטוקול מורנין התרבות epithelia שניתן לבדיל לתוך חלב מניב. טכניקת טריסיזציה דיפרנציאלית משמשת כדי לבודד את מיויואס ו-LECs המרכיבים את שני תאי התאים הייחודיים של ה-MG. אלה שברים תא מופרדים יכול לאחר מכן להיות מניפולציות גנטית כדי overexpress או מנוק פונקציה גנטית. מכיוון ששושלת-שושלת, הארגון העצמי הוא נכס מולדת של תאים אפיתל הפטמות15,16,17, שילוב מחדש של שברים אלה תאים מאפשר לחוקרים ליצור בילאיל, מארגני פסיפס. אנו מתחילים לעכל את רקמת השומן, ולאחר מכן מריטת את שברי הפטמות על צלחת תרבות הרקמה במשך 24 שעות (איור 1). שברי הרקמה מתפשרים על פוליסטירן מנות כשברים בvivo בארגון: שכבת מיואפיתל חיצונית המקיפה את שכבות הלומיאל הפנימיות. ארגון הסלולר הזה מאפשר לבידוד של היואקאס החיצוני על ידי טריפסין-EDTA (0.05%) טיפול ב3-6 דקות ואחריו סיבוב שני של טריפסין-EDTA (0.05%) טיפול המנתק את הצ הפנימי הנותר (איור 2). לפיכך, סוגי תאים אלה בעלי רגישות טריפסין שונים מבודדים ולאחר מכן יכולים להיות מעורבים ומצופים ב-ECM (איור 3). התאים עוברים ארגון עצמי כדי ליצור כדורים מבהרים, המכילים שכבה חיצונית של החברה הפנימית המקיפה את ה-LECs. היווצרות לומן מתרחשת כאשר התאים גדלים במדיום המכיל קוקטייל של גורמי גדילה (ראה מתכונים עבור צמיחה בינונית)13. לאחר 5 ימים, אורגנואידים יכול להיות מובחנים לייצור חלב על ידי מעבר למדיום מכתשי (לראות מתכונים ואיור 3F) ו מודבטים לעוד 5 ימים. לחילופין, אורגנואידים ימשיך להתרחב ולענף במדיום הצמיחה לפחות 10 ימים. אורגנואידים ניתן לנתח באמצעות immunofluorescence (איור 3D-F) או שוחרר ecm באמצעות פתרון שחזור (ראה טבלת חומרים) וניתח באמצעות שיטות אחרות (למשל, החיסוני, RT-qpcr).
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, שיטה מוצגת המפרט כיצד חוקרים יכולים ליצור תרבויות 3D אורגאיד באמצעות תאי MG הראשי. ההבדל בין זה לבין פרוטוקולים אחרים הוא שאנחנו לפרט שיטה להפריד בין שני, ברורים תאים תא מג: מmyoecs הבסיס החיצוני ו LECs הפנימי. השיטה שלנו מעסיקה טריפסין דו-שלבים (0.05%) טיפול שאנו מכנים. טריסינוניזציה משלים<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לבן אברהמס לסיוע טכני ותמיכה ליבה מאוניברסיטת קליפורניה, סנטה קרוז (UCSC) המכון לביולוגיה של תאי גזע (IBSC). אנו מודים סוזן Strome ואת ביל סאקטון לשימוש שלהם Solamere ספינינג דיסק מיקרוסקופ Confocal וקד. עבודה זו היתה נתמכת בחלקו על ידי מענקים ucsc מן המכון הרפואי הווארד יוז באמצעות מלגות ג’יימס ה. גילהם למחקר מתקדם (S.R.), מ nih (nih GM058903) עבור היוזמה למקסם את התפתחות הסטודנטים (בריאות) ומ הקרן הלאומית למדע עבור מלגת מחקר בוגרת (ה1339067) ובמענק מענק (A18-0370) מוועדת התיאום של מחקר הסרטן (LH).
Materials
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
References
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
- Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
- Ip, M. M., Asch, B. B. . Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , (2000).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
- Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
- Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
- Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message?. Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207 (2016).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).
- Runswick, S. K., O’Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).
- Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
- Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
- Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).
- Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).
- Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
- Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).
