Generatie van Mozaïek Borstorganoïden door Differentiële Trypsinization

De borstklier (MG) is een boomachtige, buisvormige epitheelstructuur ingebed in een adipocyte rijke stroma. Het tweelaagse buisepitheel bestaat uit een buitenste, basale laag contractiele, myoepitheelcellen (MyoECs) en een binnenste laag van luminale, secretoire epitheelcellen (LEC’s), die een centraal lumen^{omringen 1}. Tijdens de lactatie wanneer de buitenste MyoECs contract om melk te persen uit de binnenste alveolar LECs, de MG ondergaat tal van veranderingen die onder de controle van groeifactoren (bijvoorbeeld, EGF en FGF) en hormonen (bijvoorbeeld progesteron, insuline, en prolactine). Deze veranderingen veroorzaken de differentiatie van gespecialiseerde structuren, longblaasjes, die melk synthetiseren en afscheiden tijdens lactatie¹. De borstepithelia kan experimenteel worden gemanipuleerd met behulp van technieken waarbij ofwel epitheliale weefselfragmenten, cellen, of zelfs een enkele basale cel worden getransplanteerd in gastheer borstvetpads, vooraf gerooid van endogene borstparenchyma, en mag uitgroeien tot een volledige, functionele epitheelboom^2,3,4,5. Transplantatie is een krachtige techniek, maar het is tijdrovend en onmogelijk als een mutatie resulteert in vroege embryonale letaliteit (voorafgaand aan E14) die de redding van transplanteerbare borstanlage voorkomt. Verder willen onderzoekers vaak onderzoek doen naar de rollen van de twee verschillende compartimenten, die zijn afgeleid van stamgebonden voorlopercellen. Hoewel Cre-lox-technologie differentiële genetische manipulatie van MyoECs en LEC’s mogelijk maakt, is dit ook een tijdrovende en dure onderneming. Sinds de jaren vijftig hebben onderzoekers dus in vitro borstorganoïden gebruikt als een relatief eenvoudige en efficiënte manier om vragen over de structuur van het borstweefsel en functie^6,7aan te pakken.

In vroege protocollen die de isolatie en de cultuur van primaire borstepitheelcellen beschrijven, vonden de onderzoekers dat een demembraanmatrijmat (BME), die uit een plasmastolsel en kippenembryouittreksel wordt samengesteld, voor mg fragmenten nodig was die op een schotel worden gekweekt⁶. In de volgende decennia werden extracellulaire matrices (EPM’s, collageen en geleiachtige eiwitmatrix, uitgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoomcellen) ontwikkeld om de 3D-cultuur te vergemakkelijken en de in vivo omgeving^7,8,,9,10beter na te bootsen. Kweekcellen in 3D-matrices onthulddoor meerdere criteria (morfologie, genexpressie en hormoonresponsiviteit) dat een dergelijke micro-omgeving betere modellen in vivo fysiologische processen^9,10,11,12. Onderzoek met primaire murinecellen identificeerde belangrijke groeifactoren en morfogenen die nodig zijn voor het uitgebreide onderhoud en de differentiatie van organoïden¹³. Deze studies hebben het podium voor het protocol hier gepresenteerd, en voor de cultuur van menselijke borstcellen als 3D-organoïden, dat is nu een modern klinisch instrument, waardoor de ontdekking van geneesmiddelen en drugs testen op patiënt monsters¹⁴. Over het algemeen benadrukt organoïde kweekde de zelforganisatiecapaciteiten van primaire cellen en hun bijdragen aan morfogenese en differentiatie.

Hier gepresenteerd is een protocol om de cultuur murine epithelia die kan worden gedifferentieerd in melkproducerende acini. Een differentiële trypsinisatietechniek wordt gebruikt om de MyoECs en LEC’s te isoleren die de twee verschillende MG-celcompartimenten omvatten. Deze gescheiden celfracties kunnen dan genetisch worden gemanipuleerd om de genfunctie te overexpresseren of neer te halen. Omdat afstamming-intrinsieke, zelforganisatie is een aangeboren eigenschap van borstepitheelcellen^15,16,17, recombining deze celfracties kunnen onderzoekers om tweelaagse, mozaïek organoïden te genereren. We beginnen met enzymatisch verteren van het vetweefsel, en vervolgens het uitbroeden van de borstfragmenten op een weefsel kweekschotel voor 24 uur (Figuur 1). De weefselfragmenten vestigen zich op polystyreengerechten als tweelaagse fragmenten met hun in vivo organisatie: buitenste myoepitheellaag rond binnenarmatuurlagen. Deze cellulaire organisatie zorgt voor de isolatie van de buitenste MyoECs door trypsin-EDTA (0,05%) behandeling voor 3-6 min gevolgd door een tweede ronde trypsin-EDTA (0,05%) behandeling die de resterende binnenste LEC’s losmaakt(figuur 2). Zo worden deze celtypen met verschillende trypsinegevoeligheid geïsoleerd en vervolgens gemengd en verguld in ECM(figuur 3). De cellen ondergaan zelforganisatie om tweelagige bollen te vormen, bestaande uit een buitenste laag MyoECs rond innerlijke LEC’s. Lumenvorming treedt op als de cellen groeien in een medium met een cocktail van groeifactoren (zie recepten voor Growth Medium)¹³. Na 5 dagen kunnen organoïden worden onderscheiden in melkproducerende acini door over te schakelen op Alveologenesis Medium (zie recepten en figuur 3F)en nog 5 dagen geïncubeerd. Als alternatief zullen organoïden blijven uitbreiden en vertakken in Growth Medium gedurende ten minste 10 dagen. Organoïden kunnen worden geanalyseerd met behulp van immunofluorescentie(figuur 3D-F)of vrijgegeven uit de ECM met behulp van een hersteloplossing (zie Tabel met materialen)en geanalyseerd via andere methoden (bijvoorbeeld immunoblot, RT-qPCR).