微小トリプシン法によるモザイク乳腺オルガノイドの生成
Summary
乳腺は二重構造であり、外筋上皮および内皮上皮細胞を含む。提示は、微分トリプシン法を用いてオルガノイドを調製するためのプロトコルである。この効率的な方法により、研究者はこれら2つの細胞タイプを別々に操作して、乳腺の形態と機能における彼らの役割に関する質問を探求することができます。
Abstract
オルガノイドは、料理の利便性の中で生理学的プロセスを再現する自己組織化された3次元組織構造を提供します。マウス乳腺は、外側、収縮性筋上皮コンパートメントおよび内側の分泌状の発光コンパートメントの異なる機能を提供する2つの異なる上皮細胞コンパートメントで構成されています。ここでは、これらの区画を含む細胞を単離し、結合して乳腺形態形成および分化に対する個々の系統の寄与を調べる方法を説明する。この方法は、シンプルで効率的であり、蛍光活性化細胞選別などの高度な分離技術を必要としません。代わりに、組織を収穫して酵素的に消化し、接着組織培養皿に上皮を播種し、次に微分トリプシン化を使用して、ミノエピテリアルと高精液を約90%の純度で結び付けます。その後、細胞は細胞外マトリックスにめっきされ、培養で10日後に牛乳を生産するために分化できる二重層三次元(3D)オルガノイドに組織化されます。遺伝子変異の影響をテストするために、細胞は野生型または遺伝子操作されたマウスモデルから採取することができ、または3D培養の前に遺伝子操作することができる。この技術は、特に、ルミナルまたはミオエピテリアルコンパートメントにおける遺伝子機能の調査を可能にするモザイクオルガノイドを生成するために使用することができる。
Introduction
乳腺(MG)は、腺細胞の豊富なストロマの中に埋め込まれた木状の管状の上皮構造である。二層状管上皮は、収縮性の外部、基底層、筋上皮細胞(MyoIC)および内層のルミナル、分泌上皮細胞(LECs)を含み、中央内腔1を囲む。外側の筋膜が内側の肺胞のLECsからミルクを絞るために収縮する授乳中に、MGは成長因子(例えば、EGFおよびFGF)およびホルモン(例えばプロゲステロン、インスリンおよびプロラクチン)の制御下にある多数の変化を受ける。これらの変化は、授乳中にミルクを合成し、分泌する特殊な構造、Alveoliの分化を引き起こす1.乳腺上皮は、上皮組織断片、細胞、あるいは単一の基底細胞を宿主乳腺脂肪パッドに移植し、内因性乳腺核間腫を事前に取り除き、全体の機能的上皮樹を,3,4再構成するために成長させる技術を使用して実験的に操作,することができる。移植は強力な技術ですが、突然変異が移植可能な乳腺の救助を妨げる初期の胚致死性(E14以前)をもたらす場合、それは時間がかかり、不可能です。さらに、研究者はしばしば、系統制限付き前駆細胞に由来する2つの異なるコンパートメントの役割を研究したいと考えています。Cre-lox技術はMyoICとレクチの遺伝子操作を可能にしますが、これは時間と費用のかかる事業でもあります。したがって、1950年代以降、研究者は乳腺組織の構造と機能6に関する質問に比較的簡単かつ効率的な方法としてインビトロ乳腺オルガノイドを使用してきました6,7.
原発性乳腺上皮細胞の単離および培養を記述する初期のプロトコルにおいて、研究者は、血漿血栓と鶏胚抽出物で構成される基膜マトリックス(BME)が、皿6で成長したMG断片に必要であることを発見した。次の数十年の間に、細胞外マトリックス(ECM、コラーゲン、およびエンゲルブレス・ホルム-群れのマウス肉腫細胞によって分泌されるゼリー様タンパク質マトリックス)が開発され、生体内環境,7、8、9、108を模倣する3D培養を容易にした。9,107生体内の生理学的プロセスにおいてこのような微小環境により良いモデルが,,9、10、11、1210であることを複数の基準(形態、遺伝子発現、およびホルモン応答性)によって明らかにされた3Dマトリックスの細胞を培養する。1112一次マウス細胞を用いた研究では、オルガノイド13の拡張維持と分化に必要な主要な成長因子およびモルフォゲンを同定した。これらの研究は、ここで提示されるプロトコルの段階を設定し、ヒト乳房細胞の培養については、現在では現代の臨床ツールである3Dオルガノイドとして、患者サンプル14の創薬および薬物検査を可能にする。全体として、オルガノイド培養は、原発細胞の自己組織化能力と形態形成および分化への貢献を強調している。
ここで提示されるのが、乳を産生するアチーニに分化することができるマウス上皮を培養するためのプロトコルである。微分トリプシン法は、2つの異なるMGセルコンパートメントを構成するMyoICとLECを分離するために使用されます。これらの分離された細胞分画は、遺伝子操作して過剰発現またはノックダウン遺伝子機能を可能にする。系統固有の自己組織化は乳腺上皮細胞15、16、1716,の自然な15性質であるため、これらの細胞画分を組み換えて、研究者は二重層のモザイクオルガノイドを生成することができます。17脂肪組織を酵素的に消化し、その後、24時間組織培養皿上の乳腺断片をインキュベートすることから始めます(図1)。組織断片は、インビボ組織を有する二重層断片としてポリスチレン皿に沈着する:内層の明るさ層を取り巻く外筋上皮層。この細胞組織はトリプシンEDTA(0.05%)によって外側のMyoICの分離を可能にする3-6分の治療に続いてトリプシン-EDTAの第2ラウンド(0.05%)残りの内側のLEDを取り外す処理(図2)。したがって、異なるトリプシン感受性を有するこれらの細胞タイプは分離され、その後ECMで混合およびめっきすることができる(図3)。細胞は自己組織化を経て二重層球を形成し、内側のLEDを取り巻くMyoICの外層を含む。ルーメン形成は、細胞が成長因子のカクテルを含む培地で成長するにつれて起こる(成長培地のレシピを参照)13.5日後、オルボロジェネシス培地(レシピおよび図3Fを参照)に切り替えて、オルガノイドを乳産生アチーニに分化し、さらに5日間インキュベートすることができます。あるいは、オルガノイドは少なくとも10日間、成長培地で拡大し、分岐し続ける。オルガノイドは、免疫蛍光(図3D-F)を用いて分析するか、または回復溶液(材料表を参照)を用いてECMから放出し、他の方法(例えば、イムノブロット、RT-qPCR)を介して分析することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、研究者が原発MG細胞を用いて3Dオルガノイド培養を生成する方法を詳述する方法を提示する。これと他のプロトコルの違いは、外側の基底筋筋と内側のLEDの2つの異なるMGセルコンパートメントを分離する方法を詳述していることです。当社の方法は、2段階のトリプシン-EDTA(0.05%)を採用しています我々は、微分トリプシン化19と呼ぶ治療.この手順により、研究者は?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
カリフォルニア大学サンタクルス校(UCSC)幹細胞生物学研究所(IBSC)の技術支援とコアサポートに対して、ベン・エイブラムスに感謝します。私たちは、彼らのソラミアスピニングディスク共焦点顕微鏡の使用のためにスーザン・ストロームとビル・サクストンに感謝します。この研究は、ハワード・ヒューズ医学研究所からジェームズ・H・ギリアム・フェローシップ・フォー・アドバンスト・スタディ(S.R.)、NIH(NIH GM058903)から学生育成(H.M.)を最大化するためのイニシアチブの奨学金によって支えられた。大学院研究フェローシップ(O.C.DGE 1339067)とUCがん研究調整委員会(LH)からの助成金(A18-0370)による国立科学財団。
Materials
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
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