Поколение мозаичных органоидов дифференциальной трипсинизации

Мэммарийская железа (MG) представляет собой дерево-как, трубчатая эпителиальная структура встроенных в адипоцит богатых стромы. Двухслойный протоковый эпителий включает в себя внешний, базальный слой сократительных, миоэпителиальных клеток (MyoECs) и внутренний слой светящихся, секреторных эпителиальных клеток (LECs), опоясывая центральный просвет¹. Во время лактации, когда внешние MyoECs контракт выжать молоко из внутренних альвеолярных LECs, MG претерпевает многочисленные изменения, которые находятся под контролем факторов роста (например, EGF и FGF) и гормоны (например, прогестерон, инсулин и пролактин). Эти изменения вызывают дифференциацию специализированных структур, альвеолы, которые синтезируют и выделяют молоко во время лактации^1. Мэммарий эпителия может быть экспериментально манипулировать с помощью методов, в которых либо эпителиальной ткани фрагменты, клетки, или даже одной базальной клетки пересаживаются в принимающей молочной жировых прокладок, предочищенные эндогенной молочной паренхии, и позволили вырасти, чтобы восстановить весь, функциональный эпителиевдерево дерево^2,3,,5.⁵ Трансплантация является мощным методом, но это отнимает много времени и невозможно, если мутация приводит к ранней эмбриональной летальности (до E14), что предотвращает спасение трансплантации молочной анлечы. Кроме того, исследователи часто хотят исследовать роль двух различных отсеков, которые являются производными от линии ограниченных клеток-прародителей. В то время как технология Cre-lox позволяет дифференциальные генетические манипуляции MyoECs и LECs, это также трудоемкое и дорогостоящее предприятие. Таким образом, с 1950-х годов, исследователи использовали в пробирке молочных органоидов в качестве относительно простого и эффективного способа решения вопросов, касающихся структуры ткани молочной железы и функции^6,7.

В ранних протоколах, описывающих изоляцию и культуру первичных эпителиальных клеток молочной железы, исследователи обнаружили, что мембранная матрица подвала (BME), состоящая из плазменного сгустка и экстракта куриного эмбриона, была необходима для фрагментов MG, выращенных на блюде⁶. В последующие десятилетия, внеклеточные матрицы (ECMs, коллаген, и желеобразная белковая матрица, выделяемая клетками саркомы Engelbreth-Holm-Swarm) были разработаны для облегчения 3D-культуры и лучше имитировать среду vivo^7,8,9,10. Культивирование клеток в 3D-матрицах выявлено по нескольким критериям (морфология, экспрессия генов и гормональной реакции), что такая микросреда лучше моделиирует в виво физиологических процессов^9,10,11,12. Исследования с использованием первичных муринных клеток определили ключевые факторы роста и морфогены, необходимые для длительного обслуживания и дифференциации органоидов^13. Эти исследования задали основу для протокола, представленного здесь, и для культуры клеток молочной железы человека, как 3D органоидов, который в настоящее время современный клинический инструмент, позволяющий для обнаружения наркотиков и тестирования на наркотики на пациента образцов¹⁴. В целом, органоидный культивирование подчеркивает возможности самоорганизации первичных клеток и их вклад в морфогенез и дифференциацию.

Представлено здесь протокол к культуре мурин эпителии, которые могут быть дифференцированы в молочно-производящих ацини. Дифференциальная методика трипсинизации используется для изоляции MyoECs и LECs, которые состоят из двух различных отсеков ячейки MG. Эти разделенные фракции клетки можно провести генетические манипуляции, чтобы переэкспрессировать или нокдаун генной функции. Потому что родословная-внутренняя, самоорганизация является врожденным свойством молочных эпителиальных клеток^15,,16,,17, рекомбинация этих клеточных фракций позволяет исследователям генерировать двуслойные, мозаичные органоиды. Начинаем с ферментативного переваривания жировой ткани, а затем инкубации фрагментов молочной ткани на блюдо культуры тканей на 24 ч(рисунок 1). Фрагменты ткани оседают на полистироловых посудах в виде двухслойных фрагментов с их организацией in vivo: внешний миоэпителиальный слой, окружающий внутренние светящиеся слои. Эта клеточная организация позволяет изоляции внешних MyoECs трипсин-EDTA (0.05%) лечение 3-6 мин с последующим вторым раундом трипсина-ЭДТА (0.05%) лечение, которое отсоединяет оставшиеся внутренние LECs(Рисунок 2). Таким образом, эти типы клеток с различной чувствительностью трипсина изолированы и впоследствии могут быть смешаны и покрыты eCM(рисунок 3). Клетки подвергаются самоорганизации для формирования двухслойных сфер, включающих внешний слой MyoECs, окружающих внутренние LECs. Образование люмен происходит, как клетки растут в среде, содержащей коктейль факторов роста (см. рецепты для роста Medium)¹³. После 5 дней, органоиды могут быть дифференцированы в молочно-производящих ацини, переключившись на Alveologenesis Medium (см. рецепты и рисунок 3F) и инкубируется еще на 5 дней. Кроме того, органоиды будут продолжать расширяться и ветвиться в рост средних, по крайней мере 10 дней. Органоиды могут быть проанализированы с помощью иммунофлуоресценции(рисунок 3D-F) или освобождены от ECM с помощью решения восстановления (см. Таблица материалов)и проанализированы с помощью других методов (например, иммуноблот, RT-qPCR).