استخدام بيريميدين التناظري ، 5-iodo-2′-deoxyuridine (IdU) مع علامات دورة الخلية لإنشاء مراحل دورة الخلية في منصة قياس الخلايا الجماعية
Summary
يقوم هذا البروتوكول بتكييف قياسات دورة الخلية لاستخدامها في منصة قياس الخلايا الجماعية. مع قدرات متعددة المعلمات لقياس الكتلة الخلوية ، يسمح القياس المباشر لدمج اليود بتحديد الخلايا في المرحلة S بينما تتيح علامات الدورة داخل الخلايا توصيف كل حالة دورة خلية في مجموعة من الظروف التجريبية.
Abstract
يعد تنظيم مرحلة دورة الخلية جانبا مهما من جوانب الانتشار الخلوي والاتزان الداخلي. يعد تعطيل الآليات التنظيمية التي تحكم دورة الخلية سمة من سمات عدد من الأمراض ، بما في ذلك السرطان. تتطلب دراسة دورة الخلية القدرة على تحديد عدد الخلايا في كل جزء من تقدم دورة الخلية وكذلك التحديد الواضح بين كل مرحلة من مراحل دورة الخلية. يوفر ظهور القياس الخلوي الشامل (MCM) إمكانات هائلة لتحليل الخلية المفردة عالية الإنتاجية من خلال القياسات المباشرة للنظائر الأولية ، كما أن تطوير طريقة لقياس حالة دورة الخلية بواسطة MCM يزيد من فائدة MCM. هنا نصف طريقة تقيس مباشرة 5-iodo-2′-deoxyuridine (IdU) ، على غرار 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) ، في نظام MCM. يوفر استخدام MCM المستند إلى IdU العديد من المزايا. أولا ، يتم دمج IdU بسرعة في الحمض النووي أثناء تخليقه ، مما يسمح بقياس موثوق للخلايا في المرحلة S مع حضانات قصيرة تصل إلى 10-15 دقيقة. ثانيا ، يتم قياس IdU دون الحاجة إلى أجسام مضادة ثانوية أو الحاجة إلى تدهور الحمض النووي. ثالثا ، يمكن دمج تلطيخ IdU بسهولة مع قياس سيكلين B1 ، وبروتين الورم الأرومي الشبكي المفسفر (pRb) ، والهستون المفسفر H3 (pHH3) ، والذي يوفر مجتمعة تحديدا واضحا لمراحل دورة الخلية الخمس. يسمح الجمع بين علامات دورة الخلية هذه مع العدد الكبير من المعلمات الممكنة مع MCM بالاندماج مع العديد من المقاييس الأخرى.
Introduction
يتيح قياس الكتلة الخلوي الكشف عن ما يقرب من 40 معلمة من خلال الاستفادة من الدقة العالية والطبيعة الكمية لتحليل الطيف الكتلي. تستخدم الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية بدلا من الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور التي تسمح بعدد أكبر من القنوات وتنتج الحد الأدنى من التداعيات 1,2. MCM له مزايا وعيوب فيما يتعلق بتحليل دورة الخلية مقارنة بقياس التدفق الخلوي. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية ل MCM في أن العدد الكبير من المعلمات يتيح القياس المتزامن لحالة دورة الخلية عبر عدد كبير من أنواع الخلايا التائية المتميزة المناعية في عينات غير متجانسة للغاية. تم استخدام MCM بنجاح لقياس حالة دورة الخلية أثناء تكون الدم الطبيعي في نخاع العظمالبشري 3 ونماذج الفئران المعدلة وراثيا لنقص التيلوميراز4. أظهر تحليل حالة دورة الخلية في ابيضاض الدم النخاعي الحاد (AML) أن دورة الخلية مرتبطة بالاستجابات المعروفة للعلاجات السريرية ، مما يوفر نظرة ثاقبة في الجسم الحي للخصائص الوظيفية التي يمكن أن تفيد اختيارات العلاج5. الميزة الثانية لتحليل دورة الخلية الخلوية الجماعية هي القدرة على قياس عدد كبير من العلامات الوظيفية الأخرى التي قد تكون مرتبطة بحالة دورة الخلية. تمكنت الأعمال الحديثة من ربط تخليق البروتين والحمض النووي الريبي بحالة دورة الخلية من خلال استخدام IdU والأجسام المضادة الموسومة بالمعدن إلى BRU و rRNA6. هذا النوع من التحليل البارامتري للغاية الذي يقيس حالة دورة الخلية عبر العديد من المجموعات السكانية في سلسلة متصلة من التمايز سيكون شبه مستحيل مع تقنية قياس التدفق الخلوي الحالية. العيب الرئيسي ل MCM هو عدم وجود بقع الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي مماثلة لتلك المستخدمة في قياس التدفق الخلوي الفلوري (على سبيل المثال ، DAPI ، Hoechst ، Pyronin Y ، إلخ). يمكن أن تعطي الأصباغ الفلورية قياسات دقيقة نسبيا لمحتوى الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، ولكن هذه الدقة ممكنة فقط بسبب التغيرات في خصائص الفلورسنت لهذه الأصباغ التي تحدث عند الإقحام بين قواعد النيوكليوتيدات. وبالتالي فإن تحليل MCM غير قادر على قياس محتوى الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي بدقة مماثلة. بدلا من ذلك ، يعتمد تحليل دورة الخلية الخلوية الجماعية على قياسات البروتينات المتعلقة بحالة دورة الخلية مثل سيكلين B1 ، وبروتين الورم الأرومي الشبكي المفسفر (pRb) ، وهيستون H3 المفسفر (pHH3) جنبا إلى جنب مع القياس المباشر لذرة اليود من دمج IdU في خلايا المرحلة S. ينتج عن هذين النهجين للقياس نتائج متشابهة للغاية أثناء الانتشار الخلوي الطبيعي ، ولكن يمكن أن يكونا متنافرين عندما يتعطل تقدم دورة الخلية.
يعد قياس عدد الخلايا في كل مرحلة من مراحل دورة الخلية أمرا مهما في فهم تطور دورة الخلية الطبيعية وكذلك اضطراب دورة الخلية ، والذي يلاحظ بشكل شائع في السرطانات والأمراض المناعية. يوفر MCM قياسا موثوقا للعوامل خارج الخلية وداخل الخلايا باستخدام الأجسام المضادة الموسومة بالمعادن. ومع ذلك ، كان قياس المرحلة S محدودا لأن مقحم الحمض النووي القائم على الإيريديوم لم يكن قادرا على التمييز بين الحمض النووي 2N و 4N. من أجل تحديد مراحل دورة الخلية ، طور بهبهاني طريقة تستخدم IdU بكتلة 127 ، والتي تقع ضمن نطاق مقياس الكتلة الخلوية وتسمح بالقياس المباشر للخلايا في المرحلةS 3. يتحايل هذا القياس المباشر على الحاجة إلى الأجسام المضادة الثانوية أو استخدام عوامل تغيير طبيعة الحمض النووي مثل الحمض أو DNase. بالاقتران مع علامات ركوب الدراجات داخل الخلايا ، فإنه يسمح بدقة عالية لتوزيع دورة الخلية في النماذج التجريبية.
يتكيف هذا البروتوكول مع قياسات دورة الخلية من بروتوكولات قياس التدفق الخلوي الشائعة ل MCM. توفر أساليبنا طريقة مريحة وبسيطة لتضمين معلمات دورة الخلية. يتطلب دمج IdU للعينات في المختبر من 10 إلى 15 دقيقة فقط من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، وهو أقصر من معظم بروتوكولات تلطيخ BrdU التي توصي بأوقات حضانة لعدة ساعات 3,7. يمكن تثبيت العينات المدمجة IdU و BrdU باستخدام مثبت بروتيني ثم تخزينها لبعض الوقت في مجمد -80 درجة مئوية. وهذا يسمح بأرشفة أعداد كبيرة من العينات الملطخة ب IdU لتحليل الدفعات دون تقليل جودة العينة.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح الأمثلة المقدمة هنا كيفية استخدام منصة MCM لتحليل توزيع دورة الخلية. وقد ثبت أيضا أن تحليل دورة الخلية حساس للظروف التجريبية مثل الوقت ودرجة الحرارة ، وهو اعتبار مهم يجب على الباحثين اتخاذه عند التفكير في MCM لتحليل دورة الخلية14. العينات التي تترك في التخزين لفترة قصيرة من ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا جهود بالاك صخري وحسام الخلايلة وهسياوتشي تشانغ وجوستين ليبرغر على دعمهم التجريبي. تم دعم هذا العمل من قبل برنامج زمالة بيلوتونيا. أي آراء ونتائج واستنتاجات يتم التعبير عنها في هذه المادة هي آراء المؤلف (المؤلفين) ولا تعكس بالضرورة آراء برنامج زمالة بيلوتونيا “.
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059 | Component of CSM |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | Sample centrifugation |
| Cleaved-PARP (D214) | BD Biosciences | F21-852 | Identification of apoptotic cells |
| Cyclin B1 | BD Biosciences | GNS-1 | G2 Resolution |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | Cryopreservative |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Internal metal standard for CyTOF performance |
| FACS Tube w/ mesh strainer | Corning | 08-771-23 | Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | Cell culture growth supplement |
| Helios | Fluidigm | CyTOF System/Platform | |
| Heparin | Sigma | H3393 | Staining additive to prevent non-specific staining |
| IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine) | Sigma | I7125 | Incorporates in S-phase |
| Ki-67 | eBiosciences | SolA15 | Confirmation of G0/G1 |
| MaxPar Multi Label Kit | Fluidigm | 201300 | Metal labeling kit, attaches metals to antibodies |
| Microplate Shaker | Thermo Scientific | 88880023 | Mixing samples during staining |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | 15710 | Fixative |
| pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine | Fluidigm | 201192 | Cell identification during CyTOF acquisition |
| p-H2AX (S139) | Millipore | JBW301 | Detection of DNA damage |
| p-HH3 (S28) | Biolegend | HTA28 | M-phase Resolution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Wash solution for cell culture and component of fixative solution |
| p-Rb (S807/811) | BD Biosciences | J112906 | G0/G1 Resolution |
| Proteomic Stabilizer | SmartTube Inc | PROT1 | Sample fixative |
| RPMI 1640 | Gibco | 21870-076 | Cell culture growth medium |
| Sodium Azide | Acros Organics | AC447810250 | Component of CSM/Antibody buffer, biocide |
References
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Ornatsky, O. I., et al. Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
- Raval, A., et al. Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice. PLoS One. 10 (7), 0131722 (2015).
- Behbehani, G. K., et al. Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy. Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).
- Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells. Nature Communications. 10 (1), 1185 (2019).
- Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis. Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).
- Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments. Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visualized Experiments. (122), e54394 (2017).
- Behbehani, G. K. Immunophenotyping by Mass Cytometry. Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of Visualized Experiments. (69), e4398 (2012).
- Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. , 17 (2010).
- Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry. Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).
- Campos, L., et al. Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing. Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).
- Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis. BMC Immunology. 18 (1), 6 (2017).
- Shabihkhani, M., et al. The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings. Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).
