Dieses Protokoll passt Zellzyklusmessungen für den Einsatz in einer Massenzytometrie-Plattform an. Mit den Multiparameter-Fähigkeiten der Massenzytometrie ermöglicht die direkte Messung des Jodeinbaus die Identifizierung von Zellen in der S-Phase, während intrazelluläre Zyklusmarker die Charakterisierung jedes Zellzykluszustands unter einer Reihe von experimentellen Bedingungen ermöglichen.
Die Regulation der Zellzyklusphase ist ein wichtiger Aspekt der Zellproliferation und Homöostase. Die Störung der Regulationsmechanismen, die den Zellzyklus steuern, ist ein Merkmal einer Reihe von Krankheiten, darunter auch Krebs. Die Untersuchung des Zellzyklus erfordert die Fähigkeit, die Anzahl der Zellen in jedem Teil des Zellzyklusverlaufs zu definieren und die einzelnen Zellzyklusphasen klar abzugrenzen. Das Aufkommen der Massenzytometrie (MCM) bietet ein enormes Potenzial für die Einzelzellanalyse mit hohem Durchsatz durch direkte Messungen von Elementisotopen, und die Entwicklung einer Methode zur Messung des Zellzykluszustands mittels MCM erweitert den Nutzen von MCM weiter. Hier beschreiben wir eine Methode, die 5-Iod-2′-Desoxyuridin (IdU), ähnlich wie 5-Brom-2′-Desoxyuridin (BrdU), in einem MCM-System direkt misst. Der Einsatz dieses IdU-basierten MCM bietet mehrere Vorteile. Erstens wird IdU während seiner Synthese schnell in die DNA eingebaut, was eine zuverlässige Messung von Zellen in der S-Phase mit Inkubationszeiten von nur 10-15 Minuten ermöglicht. Zweitens wird IdU gemessen, ohne dass sekundäre Antikörper oder DNA-Abbau erforderlich sind. Drittens kann die IdU-Färbung leicht mit der Messung von Cyclin B1, phosphoryliertem Retinoblastomprotein (pRb) und phosphoryliertem Histon H3 (pHH3) kombiniert werden, was zusammen eine klare Abgrenzung der fünf Zellzyklusphasen ermöglicht. Die Kombination dieser Zellzyklusmarker mit der hohen Anzahl von Parametern, die mit MCM möglich sind, ermöglicht die Kombination mit zahlreichen anderen Metriken.
Die Massenzytometrie ermöglicht die Detektion von ca. 40 Parametern, indem sie die hohe Auflösung und quantitative Natur der Massenspektroskopie nutzt. Anstelle von Fluorophor-konjugierten Antikörpern werden metallmarkierte Antikörper verwendet, die eine höhere Anzahl von Kanälen ermöglichen und einen minimalen Spillovererzeugen 1,2. MCM hat Vor- und Nachteile in Bezug auf die Zellzyklusanalyse im Vergleich zur Durchflusszytometrie. Ein großer Vorteil von MCM besteht darin, dass die große Anzahl von Parametern die gleichzeitige Messung des Zellzykluszustands über eine große Anzahl immunphänotypisch unterschiedlicher T-Zelltypen in sehr heterogenen Proben ermöglicht. MCM wurde erfolgreich eingesetzt, um den Zellzykluszustand während der normalen Hämatopoese im menschlichen Knochenmark3 und transgenen Mausmodellen des Telomerasemangels4 zu messen. Die Analyse des Zellzykluszustands bei akuter myeloischer Leukämie (AML) zeigte, dass der Zellzyklus mit bekannten Reaktionen auf klinische Therapien korrelierte, was einen In-vivo-Einblick in funktionelle Merkmale lieferte, die die Therapieauswahl beeinflussen können5. Ein zweiter Vorteil der zytometrischen Massenanalyse des Zellzyklus ist die Möglichkeit, eine große Anzahl anderer funktioneller Marker zu messen, die mit dem Zellzykluszustand korreliert werden können. Neuere Arbeiten konnten die Protein- und RNA-Synthese mit dem Zellzykluszustand korrelieren, indem IdU und metallmarkierte Antikörper gegen BRU und rRNA6 verwendet wurden. Diese Art von hochparametrischer Analyse, die den Zellzykluszustand über zahlreiche Populationen hinweg in einem Kontinuum der Differenzierung misst, wäre mit der derzeitigen Durchflusszytometrie-Technologie nahezu unmöglich. Der größte Nachteil von MCM ist das Fehlen vergleichbarer DNA- oder RNA-Färbungen, wie sie in der Fluoreszenz-Durchflusszytometrie verwendet werden (z. B. DAPI, Hoechst, Pyronin Y usw.). Fluoreszenzfarbstoffe können relativ genaue Messungen des DNA- und RNA-Gehalts liefern, aber diese Präzision ist nur aufgrund der Änderungen der Fluoreszenzeigenschaften dieser Farbstoffe möglich, die bei der Interkalation zwischen Nukleotidbasen auftreten. Die MCM-Analyse ist daher nicht in der Lage, den DNA- oder RNA-Gehalt mit ähnlicher Präzision zu messen. Stattdessen stützt sich die zytometrische Massenzellzyklusanalyse auf Messungen von Proteinen, die mit dem Zellzykluszustand in Verbindung stehen, wie z. B. Cyclin B1, phosphoryliertes Retinoblastomprotein (pRb) und phosphoryliertes Histon H3 (pHH3) in Kombination mit der direkten Messung des Jodatoms aus dem Einbau von IdU in S-Phase-Zellen. Diese beiden Messansätze liefern während der normalen Zellproliferation sehr ähnliche Ergebnisse, können aber möglicherweise diskordant sein, wenn der Zellzyklus gestört ist.
Die Messung der Anzahl der Zellen in jeder Zellzyklusphase ist wichtig, um die normale Entwicklung des Zellzyklus sowie die Unterbrechung des Zellzyklus, die häufig bei Krebs und immunologischen Erkrankungen beobachtet wird, zu verstehen. MCM ermöglicht eine zuverlässige Messung von extrazellulären und intrazellulären Faktoren mit metallmarkierten Antikörpern. Die Messung der S-Phase war jedoch eingeschränkt, da der Iridium-basierte DNA-Interkalator nicht in der Lage war, zwischen 2N- und 4N-DNA zu unterscheiden. Um Zellzyklusphasen zu definieren, entwickelte Behbehani eine Methode, die IdU mit einer Masse von 127 verwendet, die in den Bereich des Massenzytometers fällt und eine direkte Messung von Zellen in S-Phase3 ermöglicht. Durch diese direkte Messung entfällt die Notwendigkeit von Sekundärantikörpern oder der Einsatz von DNA-Vergällungsmitteln wie Säure oder DNase. In Verbindung mit intrazellulären Zyklusmarkern ermöglicht es eine hohe Auflösung der Zellzyklusverteilung in experimentellen Modellen.
Dieses Protokoll adaptiert Zellzyklusmessungen von gängigen Durchflusszytometrieprotokollen für MCM. Unsere Methoden bieten eine bequeme und einfache Möglichkeit, Zellzyklusparameter einzubeziehen. Die Inkorporation von In-vitro-Proben erfordert nur 10 bis 15 Minuten Inkubationszeit bei 37 °C, was kürzer ist als bei den meisten BrdU-Färbeprotokollen, die Inkubationszeiten von mehreren Stunden empfehlen 3,7. IdU- und BrdU-inkorporierte Proben können mit einem proteomischen Stabilisator fixiert und dann für einige Zeit in einem -80 °C Gefrierschrank gelagert werden. Auf diese Weise kann eine große Anzahl von IdU-gefärbten Proben für die Chargenanalyse archiviert werden, ohne dass die Probenqualität beeinträchtigt wird.
Die hier vorgestellten Beispiele zeigen, wie eine MCM-Plattform zur Analyse der Zellzyklusverteilung eingesetzt werden kann. Es hat sich auch gezeigt, dass die Zellzyklusanalyse empfindlich auf experimentelle Bedingungen wie Zeit und Temperatur reagiert, was eine wichtige Überlegung ist, die Forscher berücksichtigen müssen, wenn sie MCM für ihre Zellzyklusanalyse in Betracht ziehen14. Proben, die für einen kurzen Zeitraum, nicht länger als eine Stunde, gelagert werden, weisen eine IdU-Einarb…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken den Bemühungen von Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang und Justin Lyeberger für ihre experimentelle Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch das Pelotonia Fellowship Program unterstützt. Alle Meinungen, Erkenntnisse und Schlussfolgerungen, die in diesem Material zum Ausdruck gebracht werden, sind die des Autors/der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die des Pelotonia-Stipendienprogramms wider.”
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059 | Component of CSM |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | Sample centrifugation |
Cleaved-PARP (D214) | BD Biosciences | F21-852 | Identification of apoptotic cells |
Cyclin B1 | BD Biosciences | GNS-1 | G2 Resolution |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | Cryopreservative |
EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Internal metal standard for CyTOF performance |
FACS Tube w/ mesh strainer | Corning | 08-771-23 | Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run |
Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | Cell culture growth supplement |
Helios | Fluidigm | CyTOF System/Platform | |
Heparin | Sigma | H3393 | Staining additive to prevent non-specific staining |
IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine) | Sigma | I7125 | Incorporates in S-phase |
Ki-67 | eBiosciences | SolA15 | Confirmation of G0/G1 |
MaxPar Multi Label Kit | Fluidigm | 201300 | Metal labeling kit, attaches metals to antibodies |
Microplate Shaker | Thermo Scientific | 88880023 | Mixing samples during staining |
Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | 15710 | Fixative |
pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine | Fluidigm | 201192 | Cell identification during CyTOF acquisition |
p-H2AX (S139) | Millipore | JBW301 | Detection of DNA damage |
p-HH3 (S28) | Biolegend | HTA28 | M-phase Resolution |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Wash solution for cell culture and component of fixative solution |
p-Rb (S807/811) | BD Biosciences | J112906 | G0/G1 Resolution |
Proteomic Stabilizer | SmartTube Inc | PROT1 | Sample fixative |
RPMI 1640 | Gibco | 21870-076 | Cell culture growth medium |
Sodium Azide | Acros Organics | AC447810250 | Component of CSM/Antibody buffer, biocide |