Summary

Verwendung des Pyrimidin-Analogons 5-Iod-2′-Desoxyuridin (IdU) mit Zellzyklusmarkern zur Etablierung von Zellzyklusphasen in einer Massenzytometrie-Plattform

Published: October 22, 2021
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Summary

Dieses Protokoll passt Zellzyklusmessungen für den Einsatz in einer Massenzytometrie-Plattform an. Mit den Multiparameter-Fähigkeiten der Massenzytometrie ermöglicht die direkte Messung des Jodeinbaus die Identifizierung von Zellen in der S-Phase, während intrazelluläre Zyklusmarker die Charakterisierung jedes Zellzykluszustands unter einer Reihe von experimentellen Bedingungen ermöglichen.

Abstract

Die Regulation der Zellzyklusphase ist ein wichtiger Aspekt der Zellproliferation und Homöostase. Die Störung der Regulationsmechanismen, die den Zellzyklus steuern, ist ein Merkmal einer Reihe von Krankheiten, darunter auch Krebs. Die Untersuchung des Zellzyklus erfordert die Fähigkeit, die Anzahl der Zellen in jedem Teil des Zellzyklusverlaufs zu definieren und die einzelnen Zellzyklusphasen klar abzugrenzen. Das Aufkommen der Massenzytometrie (MCM) bietet ein enormes Potenzial für die Einzelzellanalyse mit hohem Durchsatz durch direkte Messungen von Elementisotopen, und die Entwicklung einer Methode zur Messung des Zellzykluszustands mittels MCM erweitert den Nutzen von MCM weiter. Hier beschreiben wir eine Methode, die 5-Iod-2′-Desoxyuridin (IdU), ähnlich wie 5-Brom-2′-Desoxyuridin (BrdU), in einem MCM-System direkt misst. Der Einsatz dieses IdU-basierten MCM bietet mehrere Vorteile. Erstens wird IdU während seiner Synthese schnell in die DNA eingebaut, was eine zuverlässige Messung von Zellen in der S-Phase mit Inkubationszeiten von nur 10-15 Minuten ermöglicht. Zweitens wird IdU gemessen, ohne dass sekundäre Antikörper oder DNA-Abbau erforderlich sind. Drittens kann die IdU-Färbung leicht mit der Messung von Cyclin B1, phosphoryliertem Retinoblastomprotein (pRb) und phosphoryliertem Histon H3 (pHH3) kombiniert werden, was zusammen eine klare Abgrenzung der fünf Zellzyklusphasen ermöglicht. Die Kombination dieser Zellzyklusmarker mit der hohen Anzahl von Parametern, die mit MCM möglich sind, ermöglicht die Kombination mit zahlreichen anderen Metriken.

Introduction

Die Massenzytometrie ermöglicht die Detektion von ca. 40 Parametern, indem sie die hohe Auflösung und quantitative Natur der Massenspektroskopie nutzt. Anstelle von Fluorophor-konjugierten Antikörpern werden metallmarkierte Antikörper verwendet, die eine höhere Anzahl von Kanälen ermöglichen und einen minimalen Spillovererzeugen 1,2. MCM hat Vor- und Nachteile in Bezug auf die Zellzyklusanalyse im Vergleich zur Durchflusszytometrie. Ein großer Vorteil von MCM besteht darin, dass die große Anzahl von Parametern die gleichzeitige Messung des Zellzykluszustands über eine große Anzahl immunphänotypisch unterschiedlicher T-Zelltypen in sehr heterogenen Proben ermöglicht. MCM wurde erfolgreich eingesetzt, um den Zellzykluszustand während der normalen Hämatopoese im menschlichen Knochenmark3 und transgenen Mausmodellen des Telomerasemangels4 zu messen. Die Analyse des Zellzykluszustands bei akuter myeloischer Leukämie (AML) zeigte, dass der Zellzyklus mit bekannten Reaktionen auf klinische Therapien korrelierte, was einen In-vivo-Einblick in funktionelle Merkmale lieferte, die die Therapieauswahl beeinflussen können5. Ein zweiter Vorteil der zytometrischen Massenanalyse des Zellzyklus ist die Möglichkeit, eine große Anzahl anderer funktioneller Marker zu messen, die mit dem Zellzykluszustand korreliert werden können. Neuere Arbeiten konnten die Protein- und RNA-Synthese mit dem Zellzykluszustand korrelieren, indem IdU und metallmarkierte Antikörper gegen BRU und rRNA6 verwendet wurden. Diese Art von hochparametrischer Analyse, die den Zellzykluszustand über zahlreiche Populationen hinweg in einem Kontinuum der Differenzierung misst, wäre mit der derzeitigen Durchflusszytometrie-Technologie nahezu unmöglich. Der größte Nachteil von MCM ist das Fehlen vergleichbarer DNA- oder RNA-Färbungen, wie sie in der Fluoreszenz-Durchflusszytometrie verwendet werden (z. B. DAPI, Hoechst, Pyronin Y usw.). Fluoreszenzfarbstoffe können relativ genaue Messungen des DNA- und RNA-Gehalts liefern, aber diese Präzision ist nur aufgrund der Änderungen der Fluoreszenzeigenschaften dieser Farbstoffe möglich, die bei der Interkalation zwischen Nukleotidbasen auftreten. Die MCM-Analyse ist daher nicht in der Lage, den DNA- oder RNA-Gehalt mit ähnlicher Präzision zu messen. Stattdessen stützt sich die zytometrische Massenzellzyklusanalyse auf Messungen von Proteinen, die mit dem Zellzykluszustand in Verbindung stehen, wie z. B. Cyclin B1, phosphoryliertes Retinoblastomprotein (pRb) und phosphoryliertes Histon H3 (pHH3) in Kombination mit der direkten Messung des Jodatoms aus dem Einbau von IdU in S-Phase-Zellen. Diese beiden Messansätze liefern während der normalen Zellproliferation sehr ähnliche Ergebnisse, können aber möglicherweise diskordant sein, wenn der Zellzyklus gestört ist.

Die Messung der Anzahl der Zellen in jeder Zellzyklusphase ist wichtig, um die normale Entwicklung des Zellzyklus sowie die Unterbrechung des Zellzyklus, die häufig bei Krebs und immunologischen Erkrankungen beobachtet wird, zu verstehen. MCM ermöglicht eine zuverlässige Messung von extrazellulären und intrazellulären Faktoren mit metallmarkierten Antikörpern. Die Messung der S-Phase war jedoch eingeschränkt, da der Iridium-basierte DNA-Interkalator nicht in der Lage war, zwischen 2N- und 4N-DNA zu unterscheiden. Um Zellzyklusphasen zu definieren, entwickelte Behbehani eine Methode, die IdU mit einer Masse von 127 verwendet, die in den Bereich des Massenzytometers fällt und eine direkte Messung von Zellen in S-Phase3 ermöglicht. Durch diese direkte Messung entfällt die Notwendigkeit von Sekundärantikörpern oder der Einsatz von DNA-Vergällungsmitteln wie Säure oder DNase. In Verbindung mit intrazellulären Zyklusmarkern ermöglicht es eine hohe Auflösung der Zellzyklusverteilung in experimentellen Modellen.

Dieses Protokoll adaptiert Zellzyklusmessungen von gängigen Durchflusszytometrieprotokollen für MCM. Unsere Methoden bieten eine bequeme und einfache Möglichkeit, Zellzyklusparameter einzubeziehen. Die Inkorporation von In-vitro-Proben erfordert nur 10 bis 15 Minuten Inkubationszeit bei 37 °C, was kürzer ist als bei den meisten BrdU-Färbeprotokollen, die Inkubationszeiten von mehreren Stunden empfehlen 3,7. IdU- und BrdU-inkorporierte Proben können mit einem proteomischen Stabilisator fixiert und dann für einige Zeit in einem -80 °C Gefrierschrank gelagert werden. Auf diese Weise kann eine große Anzahl von IdU-gefärbten Proben für die Chargenanalyse archiviert werden, ohne dass die Probenqualität beeinträchtigt wird.

Protocol

1. Aufbereitung von IdU-Beständen 5-Iod-2′-Desoxyuridin (IdU) in DMSO bis zu einer Konzentration von 50 mM lösen. Sterilfilter, aliquot in 10-50 μL Röhrchen und bei -80 °C lagern IdU aus dem Gefrierschrank nehmen und bei Raumtemperatur auftauen. IdU in RPMI-1640 verdünnen, um eine funktionierende Lösung mit einer Endkonzentration von 1 mM herzustellen. Pipettieren Sie auf und ab oder wirbeln Sie zum Mischen.In der Regel wird das konzentrierte IdU in das Medium verdünnt, in dem die Zell…

Representative Results

Mit Hilfe von HL-60-Zellen und einem humanen Knochenmarkaspirat kann gezeigt werden, wie experimentelle Bedingungen die Zellzyklusverteilung und -analyse beeinflussen können. Zunächst muss die Gating-Strategie festgelegt werden, um zu zeigen, wie die Zellzyklusphasen abgeleitet werden. In Abbildung 1 zeigen wir die Etablierung des Singulett-Gates, das für die Trennung von Zelltrümmern und Dubletten wichtig ist, wodurch eine Einzelzellpopulation entsteht. Für Zelllinien genügt das Singu…

Discussion

Die hier vorgestellten Beispiele zeigen, wie eine MCM-Plattform zur Analyse der Zellzyklusverteilung eingesetzt werden kann. Es hat sich auch gezeigt, dass die Zellzyklusanalyse empfindlich auf experimentelle Bedingungen wie Zeit und Temperatur reagiert, was eine wichtige Überlegung ist, die Forscher berücksichtigen müssen, wenn sie MCM für ihre Zellzyklusanalyse in Betracht ziehen14. Proben, die für einen kurzen Zeitraum, nicht länger als eine Stunde, gelagert werden, weisen eine IdU-Einarb…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken den Bemühungen von Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang und Justin Lyeberger für ihre experimentelle Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch das Pelotonia Fellowship Program unterstützt. Alle Meinungen, Erkenntnisse und Schlussfolgerungen, die in diesem Material zum Ausdruck gebracht werden, sind die des Autors/der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die des Pelotonia-Stipendienprogramms wider.”

Materials

Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A3059 Component of CSM
Centrifuge Thermo Scientific 75-217-420 Sample centrifugation
Cleaved-PARP (D214) BD Biosciences F21-852 Identification of apoptotic cells
Cyclin B1 BD Biosciences GNS-1 G2 Resolution
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma D2650 Cryopreservative
EQ Four Element Calibration Beads Fluidigm 201078 Internal metal standard for CyTOF performance
FACS Tube w/ mesh strainer Corning 08-771-23 Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 97068-085 Cell culture growth supplement
Helios Fluidigm CyTOF System/Platform
Heparin Sigma H3393 Staining additive to prevent non-specific staining
IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine) Sigma I7125 Incorporates in S-phase
Ki-67 eBiosciences SolA15 Confirmation of G0/G1
MaxPar Multi Label Kit Fluidigm 201300 Metal labeling kit, attaches metals to antibodies
Microplate Shaker Thermo Scientific 88880023 Mixing samples during staining
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Services 15710 Fixative
pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine Fluidigm 201192 Cell identification during CyTOF acquisition
p-H2AX (S139) Millipore JBW301 Detection of DNA damage
p-HH3 (S28) Biolegend HTA28 M-phase Resolution
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190-144 Wash solution for cell culture and component of fixative solution
p-Rb (S807/811) BD Biosciences J112906 G0/G1 Resolution
Proteomic Stabilizer SmartTube Inc PROT1 Sample fixative
RPMI 1640 Gibco 21870-076 Cell culture growth medium
Sodium Azide Acros Organics AC447810250 Component of CSM/Antibody buffer, biocide

References

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Cite This Article
Devine, R. D., Behbehani, G. K. Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2′-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform. J. Vis. Exp. (176), e60556, doi:10.3791/60556 (2021).

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