Использование аналога пиримидина, 5-йод-2'-дезоксиуридина (IdU) с маркерами клеточного цикла для установления фаз клеточного цикла на платформе массовой цитометрии

Масс-цитометрия позволяет обнаруживать около 40 параметров, используя преимущества высокого разрешения и количественного характера масс-спектроскопии. Антитела, меченные металлами, используются вместо флуорофорных конъюгированных антител, которые допускают большее количество каналов и производят минимальный побочный эффект ^1,2. MCM имеет преимущества и недостатки в отношении анализа клеточного цикла по сравнению с проточной цитометрией. Одним из основных преимуществ MCM является то, что большое количество параметров позволяет одновременно измерять состояние клеточного цикла в большом количестве иммунофенотипически различных типов Т-клеток в очень гетерогенных образцах. MCM успешно используется для измерения состояния клеточного цикла при нормальном кроветворении в костном мозге^{человека 3} и трансгенных мышиных моделях дефицита теломеразы⁴. Анализ состояния клеточного цикла при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ) показал, что клеточный цикл коррелирует с известными реакциями на клиническую терапию, обеспечивая понимание in vivo функциональных характеристик, которые могут информировать о выборе терапии⁵. Вторым преимуществом массового цитометрического анализа клеточного цикла является возможность измерения большого количества других функциональных маркеров, которые могут быть коррелированы с состоянием клеточного цикла. Недавняя работа смогла коррелировать синтез белка и РНК с состоянием клеточного цикла с помощью IdU и меченных металлами антител к BRU и рРНК⁶. Такой высокопараметрический анализ, измеряющий состояние клеточного цикла в многочисленных популяциях в континууме дифференцировки, был бы практически невозможен с современной технологией проточной цитометрии. Основным недостатком MCM является отсутствие сопоставимых красителей ДНК или РНК, используемых во флуоресцентной проточной цитометрии (например, DAPI, Hoechst, Pyronin Y и т. Д.). Флуоресцентные красители могут давать относительно точные измерения содержания ДНК и РНК, но эта точность возможна только благодаря изменениям флуоресцентных свойств этих красителей, которые происходят при интеркаляции между нуклеотидными основаниями. Таким образом, анализ MCM не может измерить содержание ДНК или РНК с аналогичной точностью. Вместо этого массовый цитометрический анализ клеточного цикла основан на измерениях белков, связанных с состоянием клеточного цикла, таких как циклин B1, фосфорилированный белок ретинобластомы (pRb) и фосфорилированный гистон H3 (pHH3) в сочетании с прямым измерением атома йода от включения IdU в клетки S-фазы. Эти два подхода к измерению дают очень похожие результаты во время нормальной клеточной пролиферации, но потенциально могут быть диссонирующими, когда прогрессирование клеточного цикла нарушается.

Измерение количества клеток в каждой фазе клеточного цикла важно для понимания нормального развития клеточного цикла, а также нарушения клеточного цикла, которое обычно наблюдается при раке и иммунологических заболеваниях. MCM обеспечивает надежное измерение внеклеточных и внутриклеточных факторов с использованием метенных металлом антител; однако измерение S-фазы было ограничено, поскольку интеркалятор ДНК на основе иридия не мог различать 2N и 4N ДНК. Чтобы определить фазы клеточного цикла, Бехбехани разработал метод, в котором используется IdU с массой 127, который попадает в диапазон массового цитометра и позволяет напрямую измерять клетки в S-фазе³. Это прямое измерение обходит необходимость во вторичных антителах или использовании денатурирующих ДНК агентов, таких как кислота или ДНКаза. В сочетании с маркерами внутриклеточного цикла он обеспечивает высокое разрешение распределения клеточного цикла в экспериментальных моделях.

Этот протокол адаптирует измерения клеточного цикла из общих протоколов проточной цитометрии для MCM. Наши методы обеспечивают удобный и простой способ включения параметров клеточного цикла. Для включения образцов IdU in vitro требуется всего от 10 до 15 минут инкубации при 37 ° C, что короче, чем у большинства протоколов окрашивания BrdU, которые рекомендуют время инкубации в несколько часов ^3,7. Образцы, включенные в IdU и BrdU, могут быть зафиксированы с помощью протеомного стабилизатора, а затем храниться в течение некоторого времени в морозильной камере с температурой -80 °C. Это позволяет архивировать большое количество образцов, окрашенных IdU, для пакетного анализа без снижения качества образцов.