Utilisation de l’analogue de la pyrimidine, la 5-iod-2′-désoxyuridine (IdU) avec des marqueurs du cycle cellulaire pour établir les phases du cycle cellulaire dans une plateforme de cytométrie de masse

La cytométrie de masse permet la détection d’environ 40 paramètres en tirant parti de la haute résolution et de la nature quantitative de la spectroscopie de masse. Les anticorps marqués au métal sont utilisés à la place des anticorps conjugués fluorophores qui permettent un plus grand nombre de canaux et produisent un débordement minimal ^1,2. MCM présente des avantages et des inconvénients en ce qui concerne l’analyse du cycle cellulaire par rapport à la cytométrie en flux. L’un des principaux avantages de la MCM est que le grand nombre de paramètres permet la mesure simultanée de l’état du cycle cellulaire sur un grand nombre de types de lymphocytes T immunophénotypiquement distincts dans des échantillons très hétérogènes. MCM a été utilisé avec succès pour mesurer l’état du cycle cellulaire pendant l’hématopoïèse normale dans la moelle osseuse humaine³ et les modèles murins transgéniques de déficit en télomérase⁴. L’analyse de l’état du cycle cellulaire dans la leucémie myéloïde aiguë (LAM) a montré que le cycle cellulaire était corrélé aux réponses connues aux thérapies cliniques, fournissant un aperçu in vivo des caractéristiques fonctionnelles qui peuvent éclairer les choix de traitement⁵. Un deuxième avantage de l’analyse du cycle cellulaire cytométrique de masse est la capacité de mesurer un grand nombre d’autres marqueurs fonctionnels qui peuvent être corrélés avec l’état du cycle cellulaire. Des travaux récents ont permis de corréler la synthèse des protéines et de l’ARN avec l’état du cycle cellulaire grâce à l’utilisation d’anticorps IdU et d’anticorps marqués par des métaux dirigés contre BRU et l’ARNr⁶. Ce type d’analyse hautement paramétrique mesurant l’état du cycle cellulaire dans de nombreuses populations dans un continuum de différenciation serait presque impossible avec la technologie actuelle de cytométrie en flux. Le principal inconvénient de la MCM est l’absence de colorations d’ADN ou d’ARN comparables à celles utilisées en cytométrie en flux fluorescent (par exemple, DAPI, Hoechst, Pyronin Y, etc.). Les colorants fluorescents peuvent donner des mesures relativement précises de la teneur en ADN et en ARN, mais cette précision n’est possible qu’en raison des changements dans les propriétés fluorescentes de ces colorants qui se produisent lors de l’intercalation entre les bases nucléotidiques. L’analyse MCM est donc incapable de mesurer la teneur en ADN ou en ARN avec une précision similaire. Au lieu de cela, l’analyse du cycle cellulaire cytométrique de masse repose sur des mesures de protéines liées à l’état du cycle cellulaire telles que la cycline B1, la protéine du rétinoblastome phosphorylé (pRb) et l’histone phosphorylée H3 (pHH3) combinées à la mesure directe de l’atome d’iode provenant de l’incorporation d’IdU dans les cellules en phase S. Ces deux approches de mesure donnent des résultats très similaires pendant la prolifération cellulaire normale, mais peuvent potentiellement être discordantes lorsque la progression du cycle cellulaire est perturbée.

La mesure du nombre de cellules dans chaque phase du cycle cellulaire est importante pour comprendre le développement normal du cycle cellulaire ainsi que la perturbation du cycle cellulaire, ce qui est couramment observé dans les cancers et les maladies immunologiques. MCM fournit une mesure fiable des facteurs extracellulaires et intracellulaires à l’aide d’anticorps marqués par des métaux; cependant, la mesure de la phase S était limitée car l’intercalateur d’ADN à base d’iridium était incapable de différencier l’ADN 2N et 4N. Afin de définir les phases du cycle cellulaire, Behbehani a développé une méthode qui utilise l’IdU avec une masse de 127, ce qui se situe dans la plage du cytomètre de masse et permet une mesure directe des cellules en phase S³. Cette mesure directe contourne le besoin d’anticorps secondaires ou l’utilisation d’agents dénaturants de l’ADN tels que l’acide ou la DNase. En conjonction avec les marqueurs de cycle intracellulaire, il permet une haute résolution de la distribution du cycle cellulaire dans des modèles expérimentaux.

Ce protocole adapte les mesures du cycle cellulaire à partir des protocoles courants de cytométrie en flux pour MCM. Nos méthodes fournissent un moyen pratique et simple d’inclure des paramètres de cycle cellulaire. L’incorporation d’échantillons in vitro par IdU ne nécessite que 10 à 15 minutes d’incubation à 37 °C, ce qui est plus court que la plupart des protocoles de coloration BrdU qui recommandent des temps d’incubation de plusieurs heures ^3,7. Les échantillons incorporés d’IdU et de BrdU peuvent être fixés à l’aide d’un stabilisateur protéomique, puis conservés pendant un certain temps dans un congélateur à -80 °C. Cela permet d’archiver un grand nombre d’échantillons colorés IdU pour analyse par lots sans réduction de la qualité des échantillons.