Uso dell'analogo della pirimidina, 5-iodo-2′-deossiuridina (IdU) con marcatori del ciclo cellulare per stabilire fasi del ciclo cellulare in una piattaforma di citometria di massa
Summary
Questo protocollo adatta le misurazioni del ciclo cellulare per l’uso in una piattaforma di citometria di massa. Con le capacità multiparametriche della citometria di massa, la misurazione diretta dell’incorporazione di iodio consente l’identificazione delle cellule in fase S, mentre i marcatori del ciclo intracellulare consentono la caratterizzazione di ogni stato del ciclo cellulare in una serie di condizioni sperimentali.
Abstract
La regolazione della fase del ciclo cellulare è un aspetto importante della proliferazione cellulare e dell’omeostasi. L’interruzione dei meccanismi regolatori che governano il ciclo cellulare è una caratteristica di una serie di malattie, incluso il cancro. Lo studio del ciclo cellulare richiede la capacità di definire il numero di cellule in ogni porzione della progressione del ciclo cellulare e di delineare chiaramente tra ciascuna fase del ciclo cellulare. L’avvento della citometria di massa (MCM) offre un enorme potenziale per l’analisi di singole cellule ad alto rendimento attraverso misurazioni dirette di isotopi elementari e lo sviluppo di un metodo per misurare lo stato del ciclo cellulare mediante MCM estende ulteriormente l’utilità dell’MCM. Qui descriviamo un metodo che misura direttamente la 5-iodo-2′-deossiuridina (IdU), simile alla 5-bromo-2′-deossiuridina (BrdU), in un sistema MCM. L’uso di questo MCM basato su IdU offre diversi vantaggi. In primo luogo, l’IdU viene rapidamente incorporata nel DNA durante la sua sintesi, consentendo una misurazione affidabile delle cellule nella fase S con incubazioni di soli 10-15 minuti. In secondo luogo, l’IDU viene misurata senza la necessità di anticorpi secondari o la necessità di degradazione del DNA. In terzo luogo, la colorazione IdU può essere facilmente combinata con la misurazione della ciclina B1, della proteina del retinoblastoma fosforilato (pRb) e dell’istone fosforilato H3 (pHH3), che fornisce collettivamente una chiara delineazione delle cinque fasi del ciclo cellulare. La combinazione di questi marcatori del ciclo cellulare con l’elevato numero di parametri possibili con MCM consente la combinazione con numerose altre metriche.
Introduction
La citometria di massa consente di rilevare circa 40 parametri sfruttando l’alta risoluzione e la natura quantitativa della spettroscopia di massa. Gli anticorpi marcati con metallo vengono utilizzati al posto degli anticorpi coniugati con fluorofori che consentono un numero maggiore di canali e producono uno spillover minimo 1,2. MCM presenta vantaggi e svantaggi per quanto riguarda l’analisi del ciclo cellulare rispetto alla citometria a flusso. Uno dei principali vantaggi dell’MCM è che l’elevato numero di parametri consente la misurazione simultanea dello stato del ciclo cellulare in un gran numero di tipi di cellule T immunofenotipicamente distinti in campioni altamente eterogenei. MCM è stato utilizzato con successo per misurare lo stato del ciclo cellulare durante la normale emopoiesi nel midollo osseo umano3 e modelli murini transgenici di deficit di telomerasi4. L’analisi dello stato del ciclo cellulare nella leucemia mieloide acuta (LMA) ha mostrato che il ciclo cellulare è correlato alle risposte note alle terapie cliniche, fornendo una visione in vivo delle caratteristiche funzionali che possono informare le selezioni terapeutiche5. Un secondo vantaggio dell’analisi del ciclo cellulare citometrico di massa è la capacità di misurare un gran numero di altri marcatori funzionali che possono essere correlati con lo stato del ciclo cellulare. Recenti lavori sono stati in grado di correlare la sintesi di proteine e RNA con lo stato del ciclo cellulare attraverso l’uso di IdU e anticorpi marcati con metallo a BRU e rRNA6. Questo tipo di analisi altamente parametrica che misura lo stato del ciclo cellulare in numerose popolazioni in un continuum di differenziazione sarebbe quasi impossibile con l’attuale tecnologia di citometria a flusso. Il principale svantaggio dell’MCM è la mancanza di coloranti di DNA o RNA comparabili a quelli utilizzati nella citometria a flusso fluorescente (ad esempio, DAPI, Hoechst, Pyronin Y, ecc.). I coloranti fluorescenti possono fornire misurazioni relativamente precise del contenuto di DNA e RNA, ma questa precisione è possibile solo a causa dei cambiamenti nelle proprietà fluorescenti di questi coloranti che si verificano dopo l’intercalazione tra basi nucleotidiche. L’analisi MCM non è quindi in grado di misurare il contenuto di DNA o RNA con precisione simile. Invece, l’analisi del ciclo cellulare citometrico di massa si basa su misurazioni di proteine correlate allo stato del ciclo cellulare come la ciclina B1, la proteina del retinoblastoma fosforilato (pRb) e l’istone H3 fosforilato (pHH3) combinato con la misurazione diretta dell’atomo di iodio dall’incorporazione di IdU nelle cellule di fase S. Questi due approcci di misurazione producono risultati molto simili durante la normale proliferazione cellulare, ma possono potenzialmente essere discordanti quando la progressione del ciclo cellulare viene interrotta.
La misurazione del numero di cellule in ciascuna fase del ciclo cellulare è importante per comprendere il normale sviluppo del ciclo cellulare e l’interruzione del ciclo cellulare, che è comunemente osservato nei tumori e nelle malattie immunologiche. MCM fornisce una misurazione affidabile dei fattori extracellulari e intracellulari utilizzando anticorpi marcati con metallo; tuttavia, la misurazione della fase S era limitata in quanto l’intercalatore del DNA basato sull’iridio non era in grado di distinguere tra DNA 2N e 4N. Al fine di definire le fasi del ciclo cellulare, Behbehani ha sviluppato un metodo che utilizza IdU con una massa di 127, che rientra nell’intervallo del citometro di massa e consente la misurazione diretta delle cellule nella fase S3. Questa misurazione diretta elude la necessità di anticorpi secondari o l’uso di agenti denaturanti del DNA come acido o DNasi. In combinazione con marcatori di ciclo intracellulare, consente un’alta risoluzione della distribuzione del ciclo cellulare in modelli sperimentali.
Questo protocollo adatta le misurazioni del ciclo cellulare dai comuni protocolli di citometria a flusso per MCM. I nostri metodi forniscono un modo comodo e semplice per includere i parametri del ciclo cellulare. L’incorporazione di IdU di campioni in vitro richiede solo da 10 a 15 minuti di incubazione a 37 °C, che è più breve della maggior parte dei protocolli di colorazione BrdU che raccomandano tempi di incubazione di diverse ore 3,7. I campioni incorporati in IdU e BrdU possono essere fissati utilizzando uno stabilizzatore proteomico e quindi conservati per qualche tempo in un congelatore a -80 °C. Ciò consente di archiviare un gran numero di campioni colorati con IdU per l’analisi dei lotti senza ridurre la qualità del campione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli esempi qui presentati dimostrano come utilizzare una piattaforma MCM per analizzare la distribuzione del ciclo cellulare. È stato anche dimostrato che l’analisi del ciclo cellulare è sensibile alle condizioni sperimentali come il tempo e la temperatura, che è una considerazione importante che i ricercatori devono prendere quando considerano MCM per la loro analisi del ciclo cellulare14. I campioni lasciati in deposito per un breve periodo di tempo, non più di un’ora, avranno un’incorporazi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare gli sforzi di Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang e Justin Lyeberger per il loro supporto sperimentale. Questo lavoro è stato sostenuto dal Pelotonia Fellowship Program. Tutte le opinioni, i risultati e le conclusioni espressi in questo materiale sono quelli degli autori e non riflettono necessariamente quelli del Pelotonia Fellowship Program.
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059 | Component of CSM |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | Sample centrifugation |
| Cleaved-PARP (D214) | BD Biosciences | F21-852 | Identification of apoptotic cells |
| Cyclin B1 | BD Biosciences | GNS-1 | G2 Resolution |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | Cryopreservative |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Internal metal standard for CyTOF performance |
| FACS Tube w/ mesh strainer | Corning | 08-771-23 | Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | Cell culture growth supplement |
| Helios | Fluidigm | CyTOF System/Platform | |
| Heparin | Sigma | H3393 | Staining additive to prevent non-specific staining |
| IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine) | Sigma | I7125 | Incorporates in S-phase |
| Ki-67 | eBiosciences | SolA15 | Confirmation of G0/G1 |
| MaxPar Multi Label Kit | Fluidigm | 201300 | Metal labeling kit, attaches metals to antibodies |
| Microplate Shaker | Thermo Scientific | 88880023 | Mixing samples during staining |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | 15710 | Fixative |
| pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine | Fluidigm | 201192 | Cell identification during CyTOF acquisition |
| p-H2AX (S139) | Millipore | JBW301 | Detection of DNA damage |
| p-HH3 (S28) | Biolegend | HTA28 | M-phase Resolution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Wash solution for cell culture and component of fixative solution |
| p-Rb (S807/811) | BD Biosciences | J112906 | G0/G1 Resolution |
| Proteomic Stabilizer | SmartTube Inc | PROT1 | Sample fixative |
| RPMI 1640 | Gibco | 21870-076 | Cell culture growth medium |
| Sodium Azide | Acros Organics | AC447810250 | Component of CSM/Antibody buffer, biocide |
References
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