Uso do Análogo da Pirimidina 5-Iodo-2′-Desoxiuridina (IdU) com Marcadores do Ciclo Celular para Estabelecer Fases do Ciclo Celular em uma Plataforma de Citometria de Massa

A citometria de massa permite a detecção de aproximadamente 40 parâmetros, aproveitando a alta resolução e a natureza quantitativa da espectroscopia de massas. Anticorpos marcados com metais são usados em vez de anticorpos conjugados com fluoróforos que permitem um maior número de canais e produzem mínimo spillover ^1,2. A MCM apresenta vantagens e desvantagens em relação à análise do ciclo celular em comparação à citometria de fluxo. Uma grande vantagem da MCM é que o grande número de parâmetros permite a medição simultânea do estado do ciclo celular em um grande número de tipos de células T imunofenotipicamente distintos em amostras altamente heterogêneas. A MCM tem sido usada com sucesso para medir o estado do ciclo celular durante a hematopoese normal na medula óssea humana³ e modelos murinos transgênicos de deficiência de telomerase⁴. A análise do estado do ciclo celular na leucemia mieloide aguda (LMA) mostrou que o ciclo celular correlacionou-se com respostas conhecidas a terapias clínicas, fornecendo uma visão in vivo das características funcionais que podem informar as seleções terapêuticas⁵. Uma segunda vantagem da análise do ciclo celular por citometria de massa é a capacidade de medir um grande número de outros marcadores funcionais que podem ser correlacionados com o estado do ciclo celular. Trabalhos recentes têm sido capazes de correlacionar a síntese de proteínas e RNA com o estado do ciclo celular através do uso de anticorpos marcados com IdU e metal para BRU e rRNA⁶. Esse tipo de análise altamente paramétrica medindo o estado do ciclo celular em várias populações em um continuum de diferenciação seria quase impossível com a tecnologia atual de citometria de fluxo. A principal desvantagem da MCM é a falta de colorações de DNA ou RNA comparáveis às usadas em citometria de fluxo fluorescente (por exemplo, DAPI, Hoechst, Pyronin Y, etc.). Corantes fluorescentes podem fornecer medidas relativamente precisas do conteúdo de DNA e RNA, mas essa precisão só é possível devido às mudanças nas propriedades fluorescentes desses corantes que ocorrem na intercalação entre bases nucleotídicas. A análise de MCM é, portanto, incapaz de medir o conteúdo de DNA ou RNA com precisão semelhante. Em vez disso, a análise do ciclo celular por citometria de massa baseia-se em medições de proteínas relacionadas ao estado do ciclo celular, como ciclina B1, proteína de retinoblastoma fosforilado (pRb) e histona H3 fosforilada (pHH3) combinadas com a medição direta do átomo de iodo da incorporação de IdU em células de fase S. Essas duas abordagens de medição produzem resultados altamente semelhantes durante a proliferação celular normal, mas podem ser potencialmente discordantes quando a progressão do ciclo celular é interrompida.

A medição do número de células em cada fase do ciclo celular é importante para entender o desenvolvimento normal do ciclo celular, bem como a interrupção do ciclo celular, que é comumente observada em cânceres e doenças imunológicas. MCM fornece medição confiável de fatores extracelulares e intracelulares usando anticorpos marcados com metal; no entanto, a medição da fase S foi limitada, pois o intercalador de DNA baseado em irídio foi incapaz de diferenciar entre DNA 2N e 4N. Para definir as fases do ciclo celular, Behbehani desenvolveu um método que utiliza IdU com massa de 127, que se enquadra na faixa do citômetro de massa e permite a medição direta de células na fase S³. Essa medição direta contorna a necessidade de anticorpos secundários ou o uso de agentes desnaturantes do DNA, como ácido ou DNase. Em conjunto com marcadores de ciclagem intracelular, permite alta resolução da distribuição do ciclo celular em modelos experimentais.

Este protocolo adapta medidas do ciclo celular de protocolos comuns de citometria de fluxo para MCM. Nossos métodos fornecem uma maneira conveniente e simples de incluir parâmetros do ciclo celular. A incorporação de amostras in vitro por IdU requer apenas 10 a 15 minutos de incubação a 37 °C, o que é mais curto do que a maioria dos protocolos de coloração de BrdU, que recomendam tempos de incubação de várias horas ^3,7. As amostras incorporadas de IdU e BrdU podem ser fixadas usando um estabilizador proteômico e, em seguida, armazenadas por algum tempo em um freezer de -80 °C. Isso permite que um grande número de amostras coradas com IdU seja arquivado para análise em lote sem redução na qualidade da amostra.