Uso del análogo de pirimidina, 5-yodo-2′-desoxiuridina (IdU) con marcadores de ciclo celular para establecer fases del ciclo celular en una plataforma de citometría de masas
Summary
Este protocolo adapta las mediciones del ciclo celular para su uso en una plataforma de citometría de masas. Con las capacidades multiparamétricas de la citometría de masas, la medición directa de la incorporación de yodo permite la identificación de células en fase S, mientras que los marcadores de ciclo intracelular permiten la caracterización de cada estado del ciclo celular en una variedad de condiciones experimentales.
Abstract
La regulación de la fase del ciclo celular es un aspecto importante de la proliferación celular y la homeostasis. La interrupción de los mecanismos reguladores que rigen el ciclo celular es una característica de una serie de enfermedades, incluido el cáncer. El estudio del ciclo celular requiere la capacidad de definir el número de células en cada porción de la progresión del ciclo celular, así como de delinear claramente entre cada fase del ciclo celular. El advenimiento de la citometría de masas (MCM) proporciona un enorme potencial para el análisis de células individuales de alto rendimiento a través de mediciones directas de isótopos elementales, y el desarrollo de un método para medir el estado del ciclo celular por MCM amplía aún más la utilidad de MCM. Aquí describimos un método que mide directamente la 5-yodo-2′-desoxiuridina (IdU), similar a la 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU), en un sistema MCM. El uso de este MCM basado en IdU proporciona varias ventajas. En primer lugar, IdU se incorpora rápidamente en el ADN durante su síntesis, lo que permite una medición fiable de las células en la fase S con incubaciones tan cortas como 10-15 minutos. En segundo lugar, IdU se mide sin la necesidad de anticuerpos secundarios o la necesidad de degradación del ADN. En tercer lugar, la tinción de IdU se puede combinar fácilmente con la medición de ciclina B1, proteína de retinoblastoma fosforilada (pRb) e histona fosforilada H3 (pHH3), que colectivamente proporciona una delineación clara de las cinco fases del ciclo celular. La combinación de estos marcadores de ciclo celular con el alto número de parámetros posibles con MCM permite la combinación con muchas otras métricas.
Introduction
La citometría de masas permite la detección de aproximadamente 40 parámetros aprovechando la alta resolución y la naturaleza cuantitativa de la espectroscopia de masas. Se utilizan anticuerpos marcados con metales en lugar de anticuerpos conjugados fluoróforos que permiten un mayor número de canales y producen un derrame mínimo 1,2. MCM tiene ventajas y desventajas con respecto al análisis del ciclo celular en comparación con la citometría de flujo. Una ventaja importante de MCM es que el gran número de parámetros permite la medición simultánea del estado del ciclo celular a través de un gran número de tipos de células T inmunofenotípicamente distintos en muestras altamente heterogéneas. MCM se ha utilizado con éxito para medir el estado del ciclo celular durante la hematopoyesis normal en médula ósea humana3 y modelos murinos transgénicos de deficiencia de telomerasa4. El análisis del estado del ciclo celular en la leucemia mieloide aguda (LMA) mostró que el ciclo celular se correlacionó con respuestas conocidas a terapias clínicas, proporcionando una visión in vivo de las características funcionales que pueden informar las selecciones de terapia5. Una segunda ventaja del análisis del ciclo celular citométrico masivo es la capacidad de medir un gran número de otros marcadores funcionales que pueden estar correlacionados con el estado del ciclo celular. Trabajos recientes han podido correlacionar la síntesis de proteínas y ARN con el estado del ciclo celular mediante el uso de IdU y anticuerpos marcados con metales contra BRU y rRNA6. Este tipo de análisis altamente paramétrico que mide el estado del ciclo celular en numerosas poblaciones en un continuo de diferenciación sería casi imposible con la tecnología actual de citometría de flujo. La principal desventaja de MCM es la falta de tinciones de ADN o ARN comparables a las utilizadas en la citometría de flujo fluorescente (por ejemplo, DAPI, Hoechst, Pyronin Y, etc.). Los colorantes fluorescentes pueden dar mediciones relativamente precisas del contenido de ADN y ARN, pero esta precisión solo es posible debido a los cambios en las propiedades fluorescentes de estos colorantes que ocurren al intercalar entre las bases de nucleótidos. Por lo tanto, el análisis MCM no puede medir el contenido de ADN o ARN con una precisión similar. En cambio, el análisis del ciclo celular citométrico masivo se basa en mediciones de proteínas relacionadas con el estado del ciclo celular, como la ciclina B1, la proteína de retinoblastoma fosforilada (pRb) y la histona fosforilada H3 (pHH3) combinada con la medición directa del átomo de yodo a partir de la incorporación de IdU en células de fase S. Estos dos enfoques de medición producen resultados muy similares durante la proliferación celular normal, pero pueden ser potencialmente discordantes cuando se interrumpe la progresión del ciclo celular.
La medición del número de células en cada fase del ciclo celular es importante para comprender el desarrollo normal del ciclo celular, así como la interrupción del ciclo celular, que se observa comúnmente en cánceres y enfermedades inmunológicas. MCM proporciona una medición confiable de factores extracelulares e intracelulares utilizando anticuerpos marcados con metales; sin embargo, la medición de la fase S fue limitada ya que el intercalador de ADN basado en iridio no pudo diferenciar entre el ADN 2N y 4N. Para definir las fases del ciclo celular, Behbehani desarrolló un método que utiliza IdU con una masa de 127, que cae dentro del rango del citómetro de masas y permite la medición directa de células en la fase S3. Esta medición directa evita la necesidad de anticuerpos secundarios o el uso de agentes desnaturalizantes del ADN como ácido o DNasa. Junto con marcadores de ciclo intracelular, permite una alta resolución de la distribución del ciclo celular en modelos experimentales.
Este protocolo adapta las mediciones del ciclo celular de los protocolos comunes de citometría de flujo para MCM. Nuestros métodos proporcionan una manera conveniente y sencilla de incluir parámetros del ciclo celular. La incorporación de IdU de muestras in vitro requiere solo de 10 a 15 minutos de incubación a 37 °C, que es más corto que la mayoría de los protocolos de tinción BrdU que recomiendan tiempos de incubación de varias horas 3,7. Las muestras incorporadas a IdU y BrdU pueden fijarse utilizando un estabilizador proteómico y luego almacenarse durante algún tiempo en un congelador de -80 °C. Esto permite archivar un gran número de muestras teñidas con IdU para el análisis por lotes sin reducir la calidad de la muestra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los ejemplos presentados aquí demuestran cómo utilizar una plataforma MCM para analizar la distribución del ciclo celular. También se ha demostrado que el análisis del ciclo celular es sensible a condiciones experimentales como el tiempo y la temperatura, lo cual es una consideración importante que los investigadores deben tener al considerar MCM para su análisis del ciclo celular14. Las muestras almacenadas durante un corto período de tiempo, no más de una hora, tendrán una incorporaci?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer los esfuerzos de Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang y Justin Lyeberger por su apoyo experimental. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Becas Pelotonia. Todas las opiniones, hallazgos y conclusiones expresadas en este material son las del autor (s) y no reflejan necesariamente las del Programa de Becas Pelotonia.
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059 | Component of CSM |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | Sample centrifugation |
| Cleaved-PARP (D214) | BD Biosciences | F21-852 | Identification of apoptotic cells |
| Cyclin B1 | BD Biosciences | GNS-1 | G2 Resolution |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | Cryopreservative |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Internal metal standard for CyTOF performance |
| FACS Tube w/ mesh strainer | Corning | 08-771-23 | Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | Cell culture growth supplement |
| Helios | Fluidigm | CyTOF System/Platform | |
| Heparin | Sigma | H3393 | Staining additive to prevent non-specific staining |
| IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine) | Sigma | I7125 | Incorporates in S-phase |
| Ki-67 | eBiosciences | SolA15 | Confirmation of G0/G1 |
| MaxPar Multi Label Kit | Fluidigm | 201300 | Metal labeling kit, attaches metals to antibodies |
| Microplate Shaker | Thermo Scientific | 88880023 | Mixing samples during staining |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | 15710 | Fixative |
| pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine | Fluidigm | 201192 | Cell identification during CyTOF acquisition |
| p-H2AX (S139) | Millipore | JBW301 | Detection of DNA damage |
| p-HH3 (S28) | Biolegend | HTA28 | M-phase Resolution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Wash solution for cell culture and component of fixative solution |
| p-Rb (S807/811) | BD Biosciences | J112906 | G0/G1 Resolution |
| Proteomic Stabilizer | SmartTube Inc | PROT1 | Sample fixative |
| RPMI 1640 | Gibco | 21870-076 | Cell culture growth medium |
| Sodium Azide | Acros Organics | AC447810250 | Component of CSM/Antibody buffer, biocide |
References
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